塞来昔布对慢性低O2高CO2大鼠肺动脉高压的影响及其机制研究*

曾海环，刘灵洁，黄羽平，谢于鹏，王良兴

(温州医学院附属第一医院呼吸内科，浙江 温州 325000)

ZENG Hai-huan，LIU Ling-jie，HUANG Yu-ping，XIE Yu-peng，WANG Liang-xing

20世纪90年代中期对特异性COX-2抑制剂(SCOX-2I)的研究开始在国外兴起，作为一种新兴的抗炎药物，据认为无传统的非甾体内抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS)引起的胃肠道和肾脏毒性而被广泛应用于治疗各种急、慢性关节炎、软组织风湿病、癌性疼痛、运动性损伤、痛经及手术后疼痛等疾病。然而从 1999年第一代特异性COX-2抑制剂(SCOX-2I)塞来昔布(celecoxib)在美国上市以来，至今已发现存在许多问题，塞来昔布可减少健康受试者尿前列环素排泄，推测长期应用可能增加栓塞事件[1]。此外，SCOX-2I还与心血管栓塞事件密切相关。目前认为，服用SCOX-2I出现血栓可能是此类药物降低了前列环素(PGI2)的生成，而对血栓素A2(TXA2)不影响，从而导致血栓素与前列环素比值失衡。而血栓素和前列环素平衡失调与肺动脉高压的形成有着密切的关系[2]。因此我们设想慢性肺心病患者合并有上述疾病长期服用SCOX-2I是否安全呢?本实验拟采用慢性低O2高CO2肺动脉高压大鼠模型，观察塞来昔布对肺动脉高压肺血管重建的影响，探讨临床上慢性肺心病患者使用塞来昔布的安全性。

1 材料与方法

1.1 动物模型复制及分组

二级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，体重180-220g(由本院实验动物中心提供)，随机分为3组(n=10):(1)正常对照组(A组):作为常压氧下的对照;(2)慢性低O2高CO2组(B组)置于常压低氧高二氧化碳舱内，使O2浓度维持在8.5%-11%，CO2浓度维持在5.0%-6.5%。舱内水蒸气用无水CaCL2吸收，每天 8 h(8:00-16:00)，每周6 d，连续 4周;(3)慢性低O2高CO2四周+塞来昔布用药组(C组)，每次低O2高CO2前予塞来昔布(0.5 mg/(kg◦d)灌胃，其它条件同B组。

1.2 肺动脉和颈动脉平均压的测定

动物饲养4周后，于次日称重，用戊巴比妥钠(35-50mg/kg ip)麻醉，仰卧固定，行颈正中切口，分离右颈外静脉和左颈总动脉，采用右心导管法测量大鼠肺动脉压力。将聚乙烯塑料导管从右颈外静脉插入右心室、肺动脉，导管另一端通过YL-4型压力传感器与SJ-42型四道生理记录仪相连肺动脉压力波，计算肺动脉平均压(mean pulmonary artery pressure，mPAP)。颈总动脉插管，连接YL-3型压力传感器通过SJ-42型四道生理记录仪测颈动脉平均压(mean carotid artery pressure ，mCAP)。

1.3 测定右心室/左室+室间隔重量比

沿房室环去除心房，沿室间隔边缘剪下右心室，滤纸吸干后用电子天平分别称取右室(right ventricle，RV)和左室+室间隔(left ventricle plus septum，LV+S)的重量，以RV/(LV+S)重量比来反映右心室重量的变化。

1.4 光镜标本制作及观察

放血处死大鼠，取右下肺组织，4%多聚甲醛固定，取固定后的肺，左肺门水平横切，石蜡包埋、切片，厚度5μm，HE染色加Weigirt法弹力纤维染色，每只大鼠选1张肺组织切片，每张切片随机选取直径(50～200)μm肺细小动脉各5支，Image-Pro Plus 5.1软件(Media Cybemetics公司)测定平均血管总面积(外弹力板以内)、血管腔面积(内膜表面以内)以计算相对比值肺细小动脉管壁面积/管总面积(WT/TA)，并测定肺细小动脉管壁厚度(PAMT)。

1.5 电镜标本制作及观察

放血处死大鼠，取右肺门组织，水平横切取1 mm×1mm×1 mm大小组织，用2.5%戊二醛作前固定，1%锇酸作后固定，常规方法处理，半薄切片定位，LKB-2088型超薄切片机切片，常规染色，HITACHI-7501SS型透射电镜观察并拍照。

1.6 血浆及肺组织TXB2、6-keto-PGF1α含量测定

由于TXA2和PGI2的不稳定性，故国内外以测定TXB2、6-keto-PGF1α作为判断其浓度的指标。分别按TXB2和PGI2放免药盒操作(由北京华英生物技术研术研究所提供)

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠mPAP、W A/TA、PAMT和mCAP的比较

慢性低O2高CO2组mPAP显著高于对照组，塞来昔布组mPAP显著高于慢性低O2高CO2组;三组间mCAP比较差异无显著性。光镜下慢性低O2高CO2组与对照组相比，肺细小动脉管壁面积/管总面积(WA/TA)和肺细小动脉中膜厚度(PAMT)均显著增高;塞来昔布组WA/TA和PAMT显著高于慢性低O2高CO2组(表1)。

Tab.1 Changes of mPAP，mCAP，WA/TA，RV/(LV+S)and PAMT in three groups(，n=10)

Tab.1 Changes of mPAP，mCAP，WA/TA，RV/(LV+S)and PAMT in three groups(，n=10)

mPAP:Mean pulmonary arteria pressure;mCAP:Mean carotid arteria pressure;WA/TA:Vessel wall area/total area;PAMT:Pulmonary arteriole medial thickness;RV:Right ventricle;LV:Left ventricle;S:Septum 1 mmHg=0.133 kPa**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs hypoxic hypercapnia group

Group mPAP(mmHg) mCAP(mmHg) WA/TA PAMT(μm) RV/(LV+S)Control 10.55±0.73 128.12±2.44 0.38±0.10 17.37±1.44 0.20±0.02 Hypoxic hypercapnic 18.35±0.63** 129.80±2.59 0.62±0.09** 31.75±1.37** 0.27±0.03**Hypoxic hypercapnic+celecoxib 22.53±1.23## 130.10±3.25 0.70±0.09## 36.64±1.88## 0.29±0.05##

2.2 慢性低O2高CO2组和塞来昔布组对大鼠肺细小动脉显微结构的影响

光镜下，正常对照组肺细小动脉内弹力板自然弯曲，平滑肌层未见明显增厚，管壁均匀一致。而慢性低O2高CO2组及塞来昔布组，中膜平滑肌细胞增生，管壁增厚。

2.3 慢性低O2高CO2组和塞来昔布组对大鼠肺细小动脉超微结构的影响

电镜下，正常对照组大鼠肺细小动脉内皮细胞扁平，中膜有1～2层平滑肌细胞，平滑肌细胞之间有散在的胶原纤维，外膜为疏松的结缔组织，有少量成纤维细胞及胶原细胞。慢性低O2高CO2组大鼠肺细小动脉内皮细胞吞饮小泡增多，血管壁增厚，中膜平滑肌细胞增生，纤维细胞增多，胶原纤维密集，管腔明显狭窄，肺泡II型上皮细胞微绒毛脱落，板层小体空泡状(图1、2);塞来昔布组中膜平滑肌细胞增大、增多，胞浆肌丝丰富，平滑肌细胞间隙增宽，肺泡隔胶原纤维增生明显(图3、4)。

Fig.2 Fibrocyte-cytosis in hypoxic hypercapnia group(electron microscopy×12 k)

Fig.3 Augmentation of smoothmuscle cell，abundance of myofilament in pulmonary arterioles in hypoxic hypocapnia+celecoxib group(electron microscopy×25k)

Fig.4 Collagen fiber of pulmonary alveolus saeptum were significantly accrementition in hypoxic hypocapnia+celecoxib group(electron microscopy×20k)

2.4 各组大鼠血浆、肺匀浆TXB2、6-keto-PGF1α含量及TXB2/6-keto-PGF1α的比较

与对照组相比，慢性低O2高CO2组血浆和肺匀浆TXB2浓度、TXB2/6-keto-PGF1α比值显著增高，6-keto-PGF1α浓度显著下降;塞来昔布组与慢性低O2高CO2组相比血浆和肺匀浆6-keto-PGF1α显著降低，TXB2浓度无明显改变，TXB2/6-keto-PGF1α比值显著增高(表2、3)。

3 讨论

花生四烯酸是膜磷脂的正常组成成分，经环氧酶(COX)代谢为不稳定的前列腺素内过氧化物PGG2和PGH2，后者被一种异构酶处理成均有生理活性的前列环素(PGI2)、血栓素A2(TXA2)、前列腺素F2a(PGF2a)、前列腺素E2(PGE2)等。血栓素A2(TXA2)和前列环素(PGI2)平衡失调与肺动脉高压的形成有着密切的关系[1]。环氧酶有两种同功酶——COX-1、COX-2。COX-1呈构成性表达，介导血栓素A2的合成，血栓素A2激活血小板并促使血小板的聚集，具有收缩肺动脉、促进平滑肌细胞和纤维母细胞增殖的作用;COX-2呈诱导性表达，介导前列环素的合成，前列腺素的作用与血栓素A2正相反。

Tab.2 Content of TXB2，6-keto-PGF1αandTXB2/6-keto-PGF1αin plasma in four grous(，n=10)

Tab.2 Content of TXB2，6-keto-PGF1αandTXB2/6-keto-PGF1αin plasma in four grous(，n=10)

**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs hypoxic hypercapnia group

Group TXB2(pg/ml) 6-keto-PGF1α(pg/ml) TXB2/6-keto-PGF1α Control 205.08±7.26 145.61±5.45 1.42±0.28 Hypoxic hypercapnic 348.30±13.25** 124.00±5.20** 2.75±0.52**Hypoxic hypercapnic+celecoxib 350.53±13.09 112.50±5.21## 3.12±0.69##

Tab.3 Content of TXB2，6-keto-PGF1αand TXB2/6-keto-PGF1αin lung in four groups(，n=10)

Tab.3 Content of TXB2，6-keto-PGF1αand TXB2/6-keto-PGF1αin lung in four groups(，n=10)

*P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs hypoxic hypercapnia group

Group TXB2(pg/ml) 6-keto-PGF1α(pg/ml) TXB2/6-keto-PGF1α Control 32.20±6.52 70.25±6.27 0.45±0.05 Hypoxic hypercapnic 57.12±5.87** 55.15±3.48** 1.02±0.08**Hypoxic hypercapnic+celecoxib 58.55±6.12## 42.23±3.10## 1.39±0.11##

目前通过FDA批准的COX-2选择性抑制剂有两个，塞来昔布和罗非昔布。2004年9月30日，罗非昔布从全球市场撤回，其原因是怀疑它会增加服用者心血管事件的发生率。支持这一论断的是VIGOR(vioxx gastrointestinal outcomes research study)实验，此项研究中患者没有使用阿司匹林，结果50mg/d罗非昔布治疗组与萘普生治疗组相比，心血管事件的发生率显著增加[3]。也有报道系统性红斑狼疮患者服用塞来昔布两天后出现呼吸困难可能是因为肺栓塞的原因[4]。目前认为，由于SCOX-2I对COX-2作用比COX-1大100倍，服用SCOX-2I出现血栓可能是此类药物降低了前列环素的生成，而对血栓素不影响，从而导致血栓素与前列环素比值失衡。研究发现COX-2对肺动脉平滑肌细胞在缺氧中的反应起到正调节作用，可能由此保护肺组织。Fredenburgh等[5]通过对野生株和COX-2基因剔除株大鼠对缺氧的反应的研究发现，COX-2因子的缺失将引起慢性缺氧后肺血管重建，增强平滑肌细胞的收缩性，加剧肺动脉高压。Cathcart等[6]也发现，COX-2有弱化缺氧诱导的肺动脉高压和血管内血栓形成的作用。本人先前的研究也表明COX-2表达与低氧高二氧化碳性肺动脉高压呈负相关。提示过度抑制COX-2，可能加重肺动脉高压和肺血管结构重建[7]。

本实验发现慢性低O2高CO2大鼠与正常组相比较肺动脉压力、血浆和肺匀浆TXB2/6-keto-PGF1α明显升高。慢性低O2高CO2+celebrex组，肺动脉压力高于慢性低O2高CO2组，血浆和肺匀浆6-keto-PGF1α显著降低，TXB2/6-keto-PGF1α比值显著增高。塞来昔布可能过度抑制COX-2活性，导致PGI2合成减少，其舒血管作用、保护内皮及抗血小板聚集作用减低，而对TXA2影响不明显，本身在低氧环境下，内皮受损，血小板激活聚集，有肺小动脉血栓形成倾向。肺动脉血栓形成能加重已有的肺动脉高压和右心负荷，对肺心病的发生发展起一定促进作用。但本实验电镜观察未见肺微血栓形成，这可能与肺组织取材、塞来昔布使用的剂量不足和给药的时间不够长有关，需要进一步的研究。

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[5]Fredenburgh L E，Liang O D，Macias A A，et al.Absence of cyclooxygenase-2 exacerbates hypoxia-induced pulmonary hypertension an enhances contractility of vascular smooth muscle cells[J].Circulation，2008，117(16):2114-2122.

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