双环醇减轻超氧阴离子诱导的大鼠胸主动脉舒张功能损伤*

茹筱晨，梁科勇，雷文华，谭伊诺，夏 强

(浙江大学医学院生理学系，杭州 310058)

RU Xiao-chen，LIANG Ke-yong，LEI Wen-hua，TAN Yi-nuo，XIA Qiang

未有bicyclol心血管作用的报道。本研究旨在观察bicyclol对离体大鼠胸主动脉张力的直接作用，着重探讨bicyclol对氧化应激所致血管功能损伤的影响及其可能机制。

血管内皮功能紊乱在心血管疾病的发生发展中起了重要作用[1]。研究发现，氧化应激状态是造成血管内皮损伤的重要因素。血管壁内可产生多种活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，包括超氧阴离子()和羟自由基(HO◦)、过氧化氢(H2O2)等。实验动物模型及临床研究表明，在心血管疾病发生过程中伴随着ROS的大量释放，导致动脉内皮依赖性舒张功能受损[2，3]。双环醇(bicyclol)是中国医学科学院药物研究所研制的新型抗肝炎药。研究表明，bicyclol能对抗多种实验性肝损伤和肾缺血/复灌损伤，其机制可能与对抗氧化应激有关[4，5]。目前尚

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

bicyclol由北京协和药厂提供。苯肾上腺素(phenylephrine，PE)，乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)，硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)，吲哚美辛(indomethacin，Indo)，N-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)，焦酚(pyrogallol)均购自Sigma公司。吲哚美辛溶于含0.7%(wt/vol)碳酸钠的溶液中;L-NAME溶于二甲基亚砜(dimethyl sul-foxide，DMSO)中，DMSO终浓度不超过0.1%。Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol/L):NaCl 118.00，KCl 4.70，CaC121.25 ，KH2PO41.20，MgSO41.20，NaHCO325.00，glucose10.00。

1.2 胸主动脉环的制备

本实验采用雄性SD大鼠，体重240～280g，由浙江大学实验动物中心提供。取大鼠胸主动脉，置于4℃的Krebs-Henseleit(K-H)液中，小心去除血管周围脂肪及结缔组织，制成长约3 mm的血管环。制备去内皮血管环时，使用棉签摩擦血管环内表面以去内皮。血管环悬挂于加有37℃K-H液的浴槽中，持续通入95%O2+5%CO2的混合气体，连于张力传感器，MedLab微机生物信号采集处理系统记录血管环张力。调节至2 g预张力，每隔15 min换液1次，平衡 1 h后，加入KCl(6×10-2mol/L)收缩血管环，重复三次，以激发血管环活性。以PE(10-6mol/L)激发血管环收缩稳定后，加入ACh(10-5mol/L)检验血管内皮是否完整，若加ACh后血管舒张程度大于60%，可认为内皮基本完整;若小于60%，则认为内皮被破坏。

1.3 bicyclol对PE预收缩的主动脉环张力的影响

取内皮完整或去内皮的血管环，向浴槽加入PE(10-6mol/L)，待血管环收缩达到平台后，采用累积加药方法，加入bicyclol(10-8～10-5mol/L)。以加入bicyclol后的血管收缩幅度与PE诱发的最大收缩幅度之间的比值反映血管张力。在部分实验中，取内皮完整的血管环，加入NO合酶抑制剂L-NAME(10-4mol/L)和/或环氧化酶抑制剂Indo(10-5mol/L)，预孵育30min后，按上法测定bicyclol对PE预收缩血管张力的影响。

1.4 超氧阴离子诱导的胸主动脉舒张功能损伤

取去内皮血管环，加入焦酚(500μmol/L)，孵育15 min后洗脱，加入PE(10-6mol/L)使血管收缩达到平台后累积加入NO供体SNP(10-9～10-5mol/L)，检测主动脉环对SNP的舒张反应。以加入SNP后的血管张力幅度与PE诱发的最大收缩幅度之间的比值反映血管的舒张性能。

1.5 bicyclol对超氧阴离子所致主动脉舒张功能损伤的影响

取内皮完整血管环，以最大效应浓度的bicyclol(10-5mol/L)孵育30min后给予500μmol/L 焦酚，共孵育15 min，洗脱，加入PE使其收缩达到平台后累积加入ACh(10-9～10-5mol/L)，检测血管对ACh的舒张反应。在部分实验中，与bicyclol同时加入Indo(10-5mol/L)或L-NAME(10-4mol/L)，以观察NO和前列环素介导的内皮依赖性血管舒张反应。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 bicyclol对主动脉环的舒张作用

bicyclol(10-8～10-5mol/L)使由PE(10-6mol/L)预收缩的内皮完整主动脉环发生浓度依赖性舒张。NO合酶抑制剂L-NAME(10-4mol/L)或环氧化酶抑制剂Indo(10-5mol/L)单独预处理部分阻断了bicyclol的舒血管作用，而两者合用则使该作用完全消失(图1A)。bicyclol对去内皮主动脉环无明显的舒张效应(图1B见下页)。

2.2 超氧阴离子对主动脉内皮依赖性舒张反应的影响

ACh(10-9～10-5mol/L)引起由 PE(10-6mol/L)预收缩的内皮完整主动脉环发生浓度依赖性舒张。分别将50，100，500和1000μmol/L的焦酚加入浴槽中孵育15 min，可不同程度地抑制血管对ACh的内皮依赖性舒张反应。与对照组相比，500μmol/L焦酚可以引起ACh诱导的血管舒张效应显著减弱(表1，图2见下页)。因此，选择500μmol/L焦酚作为外源性氧化应激源，复制过氧化损伤模型。

2.3 超氧阴离子对主动脉内皮非依赖性舒张反应的影响

在PE(10-6mol/L)预收缩的去内皮主动脉环上，外源性NO供体SNP(10-9～10-5mol/L)可引起浓度依赖性舒张。与对照组相比，焦酚(500μmol/L)孵育15 min对SNP诱导的内皮非依赖性血管舒张反应无显著影响(图3见下页)。

Tab.1 Effect of pyrogallol-exposure on acetylcholine-induced relaxation in endothelium-intact rat thoracic aortic rings precontracted with phenylephrine(10-6mol/L)，pD2 and Emaxvalues were calculated(，n=6)

Tab.1 Effect of pyrogallol-exposure on acetylcholine-induced relaxation in endothelium-intact rat thoracic aortic rings precontracted with phenylephrine(10-6mol/L)，pD2 and Emaxvalues were calculated(，n=6)

Emax:Maximum response;pD2:Negative logarithm of the concentration of the drug required to produce 50%of maximum response*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Index Control Pyrogallol(μmol/L)50 100 500 1000pD2 7.00±0.04 7.04±0.05 7.01±0.05 6.62±0.17* 6.48±0.19**Emax(%) 98.32±3.37 86.77±6.64* 78.28±5.72** 40.11±9.58** 35.85±8.17**

Fig.1 Vasodilating effect of bicyclol on rat thoracic aortic rings precontracted with phenylephrine

2.4 bicyclol对氧化应激所致血管舒张功能损伤的对抗作用

与对照组相比，焦酚(500μmol/L)预孵育15 min可明显抑制ACh(10-9～10-5mol/L)诱导的内皮依赖性血管舒张反应。bicyclol(10-5mol/L)预孵育45 min可使焦酚损伤后的主动脉环舒张反应有显著改善，血管舒张幅度高于单独焦酚损伤组，但仍低于对照组(图4A)。

Indo(10-5mol/L)和L-NAME(10-4mol/L)预孵育主动脉环45 min后，ACh(10-9～10-5mol/L)可引起血管的浓度依赖性舒张。焦酚(500μmol/L)预孵育15 min显著降低了血管对ACh的反应性。与Indo同时加入bicyclol(10-5mol/L)可抑制焦酚引起的血管舒张反应降低，但对于L-NAME预处理的主动脉环，bicyclol(10-5mol/L)对焦酚诱导的血管舒张功能损伤未见显著影响(图4B，C)。

Fig.2 Effect of different concentrationsof pyrogallol on endothelium-dependent relaxation in rat thoracic aortic rings.After exposure to pyrogallol(Pyr，50，100，500，1000μmol/L)for 15 min，endothelium-intact preparations were contracted with phenylephrine(10-6mol/L)and acetylcholine(ACh，10-9～10-5mol/L)was added in a cumulative manner.The control group was treated with the solvents of pyrogallol before phenylephrine and ACh was applied(，n=6)

Fig.3 Effect of pyrogallol-exposure on endothelium-independent relaxation in rat thoracic aortic rings.After exposure to pyrogallol(Pyr，500μmol/L)for 15min，the endothelium-denuded preparationswere contracted with phenylephrine(10-6mol/L)and sodium nitroprusside(SNP，10-9～ 10-5mol/L)was added in a cumulative manner.The control group was treated with the solvents of pyrogallol before phenylephrine and SNP was applied(，n=6)

Fig.4 Effect of bicyclol on superoxide anion-induced inhibition of endothelium-dependent relaxation in rat thoracic aortic rings(，n=6)

3 讨论

本实验发现，bicyclol对由PE预收缩的大鼠内皮完整胸主动脉环产生舒张作用，该作用在去除血管内皮后消失，提示bicyclol的舒血管效应是内皮依赖性的。

血管内皮细胞可分泌多种血管活性物质，通过这些物质之间的相互平衡，调节血管平滑肌的舒缩活动。内皮分泌的血管舒张因子主要有三种，即一氧化氮(nitric oxide，NO)，前列环素(prostacyclin，PGI2)和内皮源性超极化因子(endothelium derived hyperpolarizing factor，EDHF)，三者的分布因血管类型的不同而异[7]。在小血管中，EDHF含量较高，通过开放钾通道引起平滑肌的舒张;而在主动脉(大血管)中，内皮依赖性血管舒张反应主要由NO和PGI2介导，它们分别通过cGMP途径和cAMP途径引起血管平滑肌的舒张。本实验中，运用L-NAME和吲哚美辛分别抑制NO或PGI2的生成可阻断bicyclol引起的主动脉环舒张，表明bicyclol的舒血管作用由NO途径和PGI2途径介导。

血管内皮功能失调主要表现为内皮依赖性舒张功能障碍，以NO等舒血管物质活性降低为特征。氧化应激状态下，机体组织或细胞内氧自由基生成增加和(或)清除能力降低，导致ROS蓄积而造成血管内皮损伤。焦酚被广泛用于实验性氧化应激损伤模型的复制，它在溶液中迅速自氧化产生，而在ROS损伤中起着重要作用[6]。本实验中，我们观察了不同浓度的焦酚对ACh诱导的大鼠胸主动脉环内皮依赖性舒张反应的影响，从中选择了500μmol/L焦酚作为外源性氧化应激源。该浓度可引起血管内皮依赖性舒张效应显著减弱，说明已造成血管内皮的过氧化损伤。而在去内皮的主动脉环上，焦酚不影响外源性NO供体SNP引起的内皮非依赖性舒张，说明500μmol/L这一浓度的焦酚对血管平滑肌的舒张功能无明显损伤。

Bicyclol(4，4'-二甲氧基-5，6，5'，6'-双(亚甲二氧基)-2-羟甲基-2-甲氧羰基联苯)是人工合成的一类抗病毒性肝炎新药，对乙型和丙型肝炎都有较好的对抗作用[8]。实验研究表明，bicyclol可对抗乙醇、四氯甲烷、乙酰氨基酚等多种化学毒性物质所致的实验性肝损伤，其机制可能与清除ROS、调节细胞因子及抑制细胞凋亡有关[4]。近来有文献报道，bicyclol可减轻肝和肾的缺血/复灌损伤，抑制损伤过程中的脂质过氧化，稳定线粒体膜[4，5]。由此，我们推测，bicyclol对血管的氧化应激损伤可能也存在保护作用。

本实验发现，bicyclol预处理可使焦酚损伤后的主动脉环内皮依赖性舒张反应有明显改善。NO和PGI2均参与介导ACh诱导的血管舒张反应[9，10]。用吲哚美辛阻断PGI2生成后，ACh仍可诱导主动脉环发生浓度依赖性舒张，焦酚导致的暴露则显著降低了血管对ACh的反应性，提示NO介导的舒血管作用被所抑制;同样，用L-NAME阻断NO后，焦酚也导致ACh诱导的血管舒张效应减弱，提示PGI2也被所抑制。上述结果表明，焦酚来源的可能通过抑制血管内皮NO和PGI2作用的发挥，从而导致了血管舒张功能的障碍。在NO介导的舒血管效应中，bicyclol预处理可抑制引起的血管舒张反应降低;而在PGI2介导的舒血管效应中，bicyclol无类似抗氧化损伤作用。因此，bicyclol对过氧化损伤后主动脉内皮依赖性舒张功能的改善作用可能由NO途径介导。

综上所述，对于大鼠胸主动脉，bicyclol具有内皮依赖性舒血管作用，该作用由NO和PGI2共同介导。bicyclol预处理减轻了诱导的血管内皮依赖性舒张功能障碍，其作用机制可能是对抗引起的NO舒血管途径抑制，而PGI2途径未参与bicyclol的抗氧化作用。此外，bicyclol究竟通过何种机制作用于NO途径，以及为什么PGI2途径介导了bicyclol的舒血管效应，却未参与其抗血管内皮氧化损伤作用，有待进一步深入探讨。

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