S-烯丙基-L-半胱氨酸对抗离体大鼠心肌缺血/再灌损伤作用的研究*

薛 猛，崔 洁，夏 雯，李 英，钱令波，叶治国，王会平，夏 强

(浙江大学医学院生理学系，杭州 310058)

S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine，SAC)是大蒜中一种主要的水溶性硫化物，化学性质非常稳定[1]，口服后可以迅速被吸收，在大鼠中的生物利用度高达98.2%，然后主要分布在血液、肝脏和肾脏中，最后以N-乙酰基的形式从肾脏随尿液排出。近年来，心血管疾病已经成为威胁人类健康和生存的主要原因之一，并且心血管疾病的发病率呈上升的趋势。缺血/再灌(ischemia/reperfusion，I/R)损伤导致组织损伤、功能异常甚至细胞死亡。尽管引起I/R损伤的原因有很多并且比较复杂，但是普遍认为I/R大量释放活性氧及细胞内的钙离子超载是引起损伤的主要原因。SAC在脑及肾脏I/R损伤中通过抗氧化起到保护作用已经得到证实[2]。同时研究表明大蒜素后处理能减轻家兔在体心肌I/R损伤，但具体的作用机制并不清楚。本实验旨在探讨SAC对离体大鼠心肌I/R损伤的保护作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

雄性SD大鼠，体重240～280g，由浙江大学医学实验动物中心提供。S-烯丙基-L-半胱氨酸及苏氨酸购于上海瀚鸿化工科技有限公司，考马斯亮兰试剂盒，超氧化物歧化酶试剂盒购自南京建成生物技术研究所，活性氧试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所，3-[4，5-dimethylthiazol-2-y1]-2，5-diphenyhetrazolium bromide(MTT)购自Sigma公司。

1.2 离体心脏Langendorff灌流和左室功能评价

分离SD大鼠心脏，固定于Langendorff灌流装置，以K-H液行常规恒压(76 mmHg)灌流。K-H液成分如下(mmol/L):NaCl 118.0，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO4◦7H2O 1.2，NaHCO32.5，葡萄糖 10.0，CaCl21.4，以 95%O2+5%CO2饱和，维持灌流液温度37℃。切开左心耳，将充水乳胶囊由此插入左心室，囊内压力经压力传感器，持续记录和分析左心室发展压(left ventricular developed pressure，LVDP)、心率(heart rate，HR)、左心室内压最大上升和下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure，±dP/dtmax)等血流动力学指标。

1.3 LDH活性的测定

在再灌注各时间点收集冠脉流出液，利用分光光度法测定灌流心脏流出液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)的活性。

1.4 心肌细胞活性的测定

心脏从灌流装置取下后切成薄片(1～2 mm)，37℃用1.25 g/L的MTT孵育30min，取出心肌片吸干表面水分并称湿重，按40ml/g的量加入二甲基亚砜后匀浆，离心(1000×g，10min)，取上清液1 ml在490nm处测定其吸光度。

1.5 SOD活性的测定

冰冻的心脏在匀浆液(10mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，10mmol/L sucrose，0.8%NaCl，pH 7.4)中制成10%的组织匀浆液。考马斯亮兰法定蛋白。按照超氧化物歧化酶(superoxide dimutase，SOD)试剂盒采用黄嘌呤氧化酶法测定组织匀浆中的SOD水平。

1.6 活性氧(ROS)含量的测定

将组织匀浆液用0～4℃0.86%NaCl溶液稀释至蛋白浓度为 200μg/ml，黑暗处加载 DCFH-DA探针，37℃孵育30min。485 nm激发光，530nm接受光下测得DCF的荧光强度。DCF的荧光水平反应了组织中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的含量。

1.7 实验分组

大鼠随机分为7组:(1)对照组:K-H液平衡30min，全心停灌30min，复灌120min;(2-5)SAC组:停灌前 15 min分别用含SAC(5×10-6mol/L，5×10-5mol/L，5×10-4mol/L和 5×10-3mol/L)的K-H 液灌流;(6)Thr组:停灌前 15 min用含Thr(1×10-2mol/L)的K-H液灌流。(7)SAC+Thr组:停灌前 15 min用含SAC(5×10-5mol/L)和Thr(1×10-2mol/L)的KH液灌流。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 SAC预处理对血流动力学指标的影响

SAC预处理组LVDP、RPP、±dP/dtmax的恢复明显高于对照组。Thr组跟对照组之间没有显著性差异。SAC+Thr组降低了SAC预处理对血流动力学的改善(表1～表4)。

Tab.1 Effect of pretreatment with SAC on LVDP(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

Tab.1 Effect of pretreatment with SAC on LVDP(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

SAC:S-allyl-L-cysteine;Thr:Threonine*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 5×10-5group

Group Baseline Reperfusion time(min)30 60 90 120Control 100(79.88±8.39) 78.42±9.06 74.29±5.82 57.28±6.43 51.01±5.84 SAC(5×10-6mol/L) 100(80.97±10.69) 85.54±5.55 77.69±4.63 65.01±8.30 52.75±7.36 SAC(5×10-5mol/L) 100(75.52±5.86) 97.78±12.05* 92.87±8.60** 79.92±13.58** 75.98±9.45**SAC(5×10-4mol/L) 100(85.40±17.23) 95.76±9.68* 88.74±9.88* 80.52±10.50** 72.48±15.81**SAC(5×10-3mol/L) 100(63.84±13.13) 90.39±7.84 86.44±6.88 76.59±13.10* 71.43±7.80**Thr 100(82.10±22.05) 82.36±11.45 72.35±11.51 59.21±11.78 45.20±11.14 SAC+Thr 100(89.73±9.45) 83.58±7.03 77.41±9.26# 54.75±8.08## 47.47±9.84##

Tab.2 Effect of pretreatment with SAC on RPP(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

Tab.2 Effect of pretreatment with SAC on RPP(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 5×10-5group

Group Baseline Reperfusion time(min)30 60 90 120Control 100(20667.62±2261.12)73.64±8.99 68.38±8.14 55.69±8.53 47.34±8.94 SAC(5×10-6mol/L) 100(24054.37±2374.29)82.09±5.31 71.76±4.04 59.01±7.24 46.04±5.28 SAC(5×10-5mol/L) 100(17709.97±3149.09)98.30±15.47** 80.55±9.00** 73.68±11.34* 67.82±10.82*SAC(5×10-4mol/L) 100(19566.24±4884.62)98.86±9.78** 87.74±11.74** 71.98±10.77* 65.16±16.11*SAC(5×10-3mol/L) 100(17177.25±4292.22)94.70±7.58** 82.96±3.73** 71.74±12.77* 66.00±9.81*Thr 100(22394.15±6475.45)87.14±6.28 78.54±5.04 66.30±10.92 59.82±10.11 SAC+Thr 100(24773.31±4862.99)79.47±7.84# 67.35±4.27## 46.13±5.20## 37.57±5.03##

Tab.3 Effect of pretreatment with SAC on+dP/dtmax(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

Tab.3 Effect of pretreatment with SAC on+dP/dtmax(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 5×10-5group

Group Baseline Reperfusion time(min)30 60 90 120Control 100(2376.02±359.92) 81.81±10.11 76.27±5.14 64.49±9.09 58.90±4.55 SAC(5×10-6mol/L) 100(2913.68±452.09) 89.18±4.50 79.52±3.37 66.53±8.47 59.23±10.81 SAC(5×10-5mol/L) 100(2395.07±525.93) 96.59±9.29 92.05±8.33* 79.31±10.65 71.60±11.20SAC(5×10-4mol/L) 100(2542.44±757.83) 97.41±8.47 90.19±10.31* 83.33±13.51* 75.96±15.23*SAC(5×10-3mol/L) 100(2250.03±289.44) 90.70±7.49 89.03±8.48* 80.14±8.98 79.01±9.98*Thr 100(3053.97±540.65) 87.14±6.28 78.54±5.04 66.30±10.92 59.82±10.11 SAC+Thr 100(3360.36±762.11) 86.57±11.63 75.98±8.52# 64.40±8.38 53.69±8.35#

Tab.4 Effect of pretreatment with SAC on-dP/dtmax(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

Tab.4 Effect of pretreatment with SAC on-dP/dtmax(%of baseline)in the groups hearts subjected to ischemia/reperfusion(，n=6)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 5×10-5group

Group Baseline Reperfusion time(min)30 60 90 120Control 100(-1415.45±263.95) 82.44±6.47 70.88±11.35 64.30±7.43 45.29±4.85 SAC(5×10-6mol/L) 100(-2053.86±359.49) 85.11±8.49 75.54±8.51 64.15±5.54 48.76±2.82 SAC(5×10-5mol/L) 100(-1471.58±193.59) 97.40±6.30* 91.08±5.96* 76.51±14.54 69.80±12.19**SAC(5×10-4mol/L) 100(-1453.04±366.05) 97.39±8.96* 89.39±8.75* 78.18±8.78 70.18±9.57**SAC(5×10-3mol/L) 100(-1320.42±283.35) 89.80±8.84 85.35±10.00 78.66±10.48 71.97±11.49**Thr 100(-1869.46±427.36) 87.14±6.28 78.54±5.04 66.30±10.92 59.82±10.11 SAC+Thr 100(-2001.01±215.94) 87.41±4.45 79.95±6.84 61.63±3.67# 57.03±4.31#

2.2 SAC预处理对心脏灌流液中LDH的影响

跟对照组相比，SAC预处理明显降低复灌期间冠脉流出液中LDH含量;Thr预处理对LDH的影响与对照组没有显著性差异。SAC+Thr预处理可显著减弱SAC对LDH的降低作用(图1)。

Fig.1 Effect of SAC on LDH level in the coronary efflucent during reperfusion of isolated rat heart following ischemia(n=6)

2.3 SAC预处理对心肌细胞活度的影响

SAC预处理跟对照组比较显著提高心肌细胞的活度;Thr预处理跟对照组相比没有显著性差异。SAC+Thr预处理明显降低心肌细胞的活度(图2)。

2.4 SAC预处理对心肌组织中SOD活性及ROS释放的影响

和对照组相比，5×10-5mol/L的SAC预处理显著性提高心肌组织匀浆中SOD的水平(图3 A)。同时明显降低心肌组织匀浆中ROS释放的水平(图3 B见下页)。

3 讨论

大蒜素于19世纪被发现具有抗菌的活性，于是其被广泛地用于抗细菌、病毒和真菌的感染。随着国内外对于大蒜素的关注，对于其化学结构，药理作用及临床应用的研究也不断的深入。SAC是大蒜素的主要组成成分，也是主要的有效作用成分。除抗菌，抗病毒以外，SAC还可以对抗肿瘤的发生，参与免疫反应。同时还能降低胆固醇和血压，抗血小板聚集。对许多肝脏疾病及心血管疾病有很好的预防作用。综其作用与它的抗氧化作用有很大关系。在家兔在体心肌I/R模型中给予大蒜素的干预研究表明，大蒜素的后处理能够明显改善家兔的心功能，减轻心肌病理变化。但对于具体的作用机制尚未见报道。本实验在离体大鼠心肌I/R模型上发现，SAC预处理明显改善I/R后左心室功能的变化，可减少I/R后心肌细胞的死亡，减少心肌损伤标志酶LDH的同时也降低了心肌细胞的死亡，表明SAC对心肌有一定的保护作用。LDH释放是心肌损伤的重要指标，SAC能够明显降低冠脉流出液中LDH的含量，改善灌注后左心室收缩功能，这些说明SAC预处理对缺血/复灌造成的心肌损伤有保护作用，本实验进一步的实验表明SAC能够抑制心肌中ROS的生成，同时提高了清除自由基的关键酶SOD的活性。

SAC是一种水溶性的氨基酸，不能直接透过细胞膜[1]，明确SAC如何进入细胞发挥作用至关重要。目前，在心肌细胞膜上发现有一种氨基酸转运体(alanine-serine-cysteine-transporter1，ASCT-1)，是一含有523个氨基酸的小分子蛋白[3]，可以允许丙氨酸 (alanine，Ala)、苏氨酸(threonine，Thr)半胱氨酸(cysteine，Cys)等通过。ASCT-1的总量是一定的，当细胞外液中同时有可以通过ASCT-1的Ala、Thr、Ser、Cys中的两种以上的分子，且超过ASCT-1的最大运载能力时，各物质便会相互竞争ASCT-1，互为通过心肌细胞膜的拮抗剂[4]。

在本实验研究发现，10-2mol/L的Thr预处理对心肌再灌过程中左心室收缩功能、LDH水平和再灌结束后心肌组织formazan量无显著影响，但10-2mol/L的Thr和5×10-5mol/L的SAC同时再灌可以减弱10-5mol/L的SAC对心肌I/R损伤的保护作用，提示Thr可以竞争性的抑制SAC进入细胞内的量，说明SAC与Thr可能是通过同样的转运体，即心肌细胞膜上的ASCT-1进入心肌细胞内。

正常心肌在有氧的情况下，能量主要来自于脂肪氧化，约占60～70%。其次是葡萄糖氧化供能及糖酵解途径产生的能量。当心肌缺血时，有氧氧化的三羧酸循环途径受到抑制，无氧糖酵解途径和脂肪酸氧化增加。脂肪酸氧化增加加剧了心肌缺氧，损伤增大。同时氧自由基产生增多，也可以引起脂质的过氧化[5]。在心肌I/R损伤的过程中，由于内皮细胞黄嘌呤氧化酶活性增强，心肌细胞线粒体呼吸链中电子的重新活化，再灌后期NADPH氧化酶的活性的增强，使得心肌细胞生活的微环境中产生过量的氧自由基。这些氧自由基会损伤生物膜、引起DNA断裂，通过促进肌浆网中Ca2+的释放而直接或间接诱导线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的开放，在炎症后期还可以激活炎性细胞因子，所有这些变化最终会促使I/R心肌细胞的死亡，导致心肌的梗死[6]。

正常情况下，体内存在一定的氧自由基，也会有维生素E、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化的物质来中和这些氧自由基，处于相对平衡的状态[7]，当抗氧化的物质减少，或氧化的物质增多时，氧化与抗氧化之间的平衡被打破，便会造成氧化损伤[8]。

已有的研究表明，SAC可以清除氧自由基。SAC可以通过抗氧化作用减轻脑缺血/再灌注引起的线粒体功能损伤[9]。在本实验中发现，SAC可以减少心肌组织匀浆中ROS的水平，提高心肌组织匀浆中SOD的活性。SAC预处理对抗缺血/复灌心肌损伤的保护作用可能与其可以清除氧自由基有关。氧自由基的水平与mPTP的开放程度，及相关的细胞传导通路等有关[10]，SAC预处理能否抑制mPTP通道的开放和调节相关的细胞传导通路还有待进一步的研究。

综上所述，SAC具有抗心肌缺血/再灌损伤的保护作用，其机制可能与SAC通过心肌细胞膜上的氨基酸转运体ASCT-1进入心肌细胞内，清除心肌细胞内的氧自由基，提高清除自由基的SOD活性有关。

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