四种防脱片剂在不脱钙骨组织切片中的应用研究

王东胜 赵 征 吕 燕

不脱钙骨组织切片，因包埋介质为树脂，不同于石蜡切片通过高温烘烤，石蜡熔化而使切片完全贴合于载玻片上。玻片在捞取切片前均需进行涂布或浸泡防脱片剂的处理。因包埋介质的不同，对于防脱片剂的选择就会有差别，如选择不当，切片与载玻片贴合不牢，易出现大量切片脱片的问题。针对不脱钙骨切片在染色中易脱片的情况，我们对病理实践中常采用的3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES)、铬明矾-明胶、多聚赖氨酸、进口玻片胶等四种防脱片剂进行了对比实验，取得了满意的实验结果。

1.材料与方法

1.1 主要试剂 防脱片剂：3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES)、铬明矾-明胶、多聚赖氨酸、已涂防脱片胶的进口玻片。Goldner's三色法染色液[1]。

1.2 方法

1.2.1 防脱片剂配制 (1)APES：配制方法为1份APES，50份丙酮，试剂最好现配现用。取洁净玻片于APES丙酮液中浸泡20s，取出后入丙酮液漂洗一下后取出，于空气中自然干燥，取出放置于载玻片盒中以防灰尘。处理好的玻片最好于3个月内用完。(2)多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸原液1份，加10份去离子水，混匀后使用。将洁净玻片浸泡5min，取出空气中自然干燥，放置于载玻片盒中。(3)铬明矾-明胶：将2.5g明胶加热溶于500 mL蒸馏水中，完全溶解后加入0.25 g硫酸铬钾搅拌充分溶解后，将玻片浸泡溶液中2 min，取出空气中自然干燥，放置于载玻片盒中。在实际应用中，采用浸泡法处理的玻片经HE染色后，玻片上易出现明胶干燥后留下的水印，影响切片的观察。经采用临检科推血片的方法，使明胶液均匀布满玻片上，切片染色后颜色均匀一致，取得满意效果。

1.2.2 不脱钙切片 采用Leica 2500E重型切片机制作不脱钙骨切片，切片厚度5μm。切片分别采用经APES、铬明矾-明胶、多聚赖氨酸处理过的玻片，以及已涂防脱片胶的进口玻片捞取。每种防脱片剂处理的玻片捞取20张，用自制夹具夹紧，于50℃烤箱中过夜。

1.2.3 染色 切片经3次脱塑剂处理，每次浸泡20min，由100%乙醇下行入水，切片均用Goldners’三色法染色[1]。

1.2.4 脱片统计 脱片统计分四个等级：(1)贴片完整(见图1)；(2)轻度脱片：脱片面积小于10%(见图 2)；(3)中度脱片：脱片面积为 10%-50%(见图3)；(4)重度脱片：脱片面积大于50%，或组织全部脱落(见图4)。

2.结果

经使用四种防脱片剂处理后的玻片捞取不脱钙骨切片，染色后比较，从附表中可以看出，脱片率最低的是经铬明矾-明胶处理的玻片，完整贴片率为75%；效果最差的是APES处理组，完整贴片率仅为15%；多聚赖氨酸处理组和进口防脱片胶处理组完整贴片率均为30%。

采用经铬明矾-明胶处理的玻片所做的不脱钙骨切片、带支架血管切片均取得满意的效果。

附表 四种防脱片剂帖片效果比较

3.讨论

在日常病理制片，特别是对切片进行免疫组化染色时，对玻片进行防脱片处理是保证制片成功至为关键的一步。以往文献对于APES、多聚赖氨酸和铬明矾-明胶等多种防脱片剂的比较均有报道[2-5]。有些研究者还通过对玻片表面进行多次处理，确保其表面清洁；或对多聚赖氨酸进行改良，以提高其防脱片的效果[6,7]，进行了多角度的研究。通过复习文献，我们发现以上研究多针对石蜡切片或脱钙骨、牙齿切片防脱片剂的选择[8]，对不脱钙骨切片防脱片剂选择及比较应用的研究较少。

我们在最初制作不脱钙骨切片的实践中是采用铬明矾-明胶对玻片进行浸泡处理，尽管防脱片效果较好，但因防脱片剂干燥后留下的痕迹影响了染色效果，后改用APES进行防脱片处理，但实际效果并不理想。

虽然APES和多聚赖氨酸是目前病理制片中最为常用的两种防脱片剂，但从附表比较结果来看，其对于不脱钙骨切片并非最佳选择。而已涂防脱片剂的进口玻片防脱片效果一般，且价格昂贵，并不适用于日常病理研究。以上四种防脱片剂中，价格由高至低依次为：进口玻片、多聚赖氨酸、APES、铬明矾-明胶。通过本实验比较，防脱片效果由好至差分别为铬明矾-明胶、多聚赖氨酸、进口玻片、APES。可看出铬明矾-明胶价格低，且对于不脱钙骨切片防脱片效果优良，为最佳选择。

在以往文献中使用铬明矾-明胶对玻片处理的方法多为浸泡法，但由于玻片的洁净度、浸泡液的杂质残留量、玻片的平整度等因素，使处理后的玻片表面易留下处理液的痕迹，影响最终的染色效果。我们借鉴临检科血液推片法，使用吸管滴加少量铬明矾-明胶液，缓慢均匀地将液体推布于玻片上，再将玻片直立放置于染色架中，室温自然干燥后收入切片盒防尘保存，并标明方向。经此方法处理后的切片，解决了原浸泡法产生的“花片”问题，提高了切片的制作质量。在玻片处理中应根据制作切片的数量准备玻片，处理好的玻片存放时间不宜超过三个月，尤其是夏天。因明胶主要为蛋白质成份，放置时间过长易变质，防脱片效果会减弱。

从对四种病理制片中常用的防脱片剂的比较研究，我们认为铬明矾-明胶是不脱钙骨切片最理想的防脱片剂，且使用经改进后的玻片处理方法，可以得到良好的染色效果。

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[4]虞 杰，顾冬梅，郭临川.防脱片剂在免疫组织化学染色中的应用[J].中国血液流变学杂志，2008,18(3)：432-433

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[6]苏明明,金 澎,齐兆鹏.厚树脂切片的防脱片方法比较[J].青岛大学医学院学报，2011，47(4)：344-345

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