松茸多糖对不同肿瘤细胞系的体外抗肿瘤作用

张治业

(河南科技大学第一附属医院，河南洛阳 471003)

松茸属担子菌亚门、层菌属、伞菌目、口蘑科、口蘑属，具有很高的营养价值和药用价值。松茸含有多糖、氨基酸、蛋白质、多肽、萜类以及多种酶，国内外对其多糖虽有报道[1～3]，但缺乏系统分析研究。2010年 10～12月，我们提取松茸多糖组分，并检测其对人神经胶质瘤细胞系(U87)、人宫颈癌(He-La)、人胰腺导管上皮癌(PANC-1)以及人乳腺癌细胞系(MCF-7)的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料 二氧化碳培养箱(美国 Forma公司)，Thermo Multiskan MK3酶标仪(美国 Thermo公司)，5417R型台式高速冷冻离心机(德国 Eppendorf公司)，F-4500紫外分光光度计(日本 Hitachi公司)，FACSCalibur流式细胞仪(美国 Becton Dickinson公司)，CKX41倒置显微镜(日本 Olympus公司)，2720型 PCR仪 (美国 Applied Biosystems公司)，Tannon水平及垂直电泳槽(上海天能科技有限公司)，Tanon 3500凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)。DMEM培养基购自 Thermo公司，RPMI-1640培养基 (美国 Gibco公司 )，胎牛血清 (FBS，杭州四季青公司)。U87以及 MCF-7细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，其他试剂为国产分析纯等。Trizol试剂(美国 Invitrogen公司)，MMMV逆转录酶和 Ex Taq酶(日本 TaKaRa公司)，p53、18SRNA引物(上海生工生物工程技术有限公司合成)，二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶 (PI)和RNase以及其他常用生物试剂购自 Sigma公司(Sigma，USA)。松茸多糖由本实验室根据文献[4]自松茸中提取，松茸多糖用培养基配成 200μg/ml的储存液，使用前用培养基稀释到所需浓度。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 U87、PANC-1、MCF-7细胞用含10%FBS的 DMEM培养，HeLa细胞用含 10%FBS的 RPMI-1640培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 MTT法测定细胞生长 将处于对数生长期细胞接种于 96孔微量培养板内，培养 24 h待细胞贴壁后加入不同浓度的松茸多糖，每个浓度设 3个复孔(边缘孔不加样品，以避免“边缘效应”)，并设相应浓度的溶媒(即不加样品，仅加相应体积的样品溶解液)对照及无细胞调零孔。药物与细胞在 37℃、5%CO2条件下共孵育 48 h后加入 MTT，置培养箱中反应 4 h，弃去孔中培养基和 MTT后加入 150 μl/孔的 DMSO，震荡溶解生成的紫色结晶后立即用酶标仪在 570 nm和 630 nm波长处检测 96孔平板中每孔细胞的光密度值(OD值)，测定波长为 570 nm，校正波长为 630 nm，所得值再减去空白的吸光度。按照公式(1-OD处理组/OD对照组)×100%计算肿瘤生长抑制率。

1.2.3 流式细胞术分析细胞周期 细胞经松茸多糖处理一定时间后，胰酶消化收集细胞，4℃固定在预冷的 70%乙醇中。检测前离心弃去固定液，用PBS洗 2遍后，将细胞重悬在含 50 mg/L RNase和50 mg/L PI的 PBS中 ，调整细胞数为 1×106个 /ml，室温置暗处染色 30 min，300目尼龙膜过滤后用流式细胞仪检测 DNA含量，采用 ModiFit软件进行细胞周期分析。

1.2.4 半定量 RT-PCR分析 细胞经松茸多糖处理一定时间后，用 Trizol试剂依照说明提取总 RNA，取 1μg RNA用 M-MLV逆转录酶和随机引物合成cDNA。采用 p53引物进行 PCR反应扩增目的基因。PCR反应条件为 95℃变性 50 s，56℃退火 50 s，72℃延伸 55 s，p53为 30个循环，18S RNA为 25个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，用计算机图像扫描分析系统测定电泳条带光密度值，p53表达水平以该条带密度与 18SRNA的百分比(%)表示。

1.3 统计学方法 采用 SPSS12.0统计学软件，数据以±s表示 ，组间比较采用 t检验 。 P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 松茸多糖对 U87、HeLa、PANC-1以及 MCF-7细胞影响 不同浓度的松茸多糖(高、中、低剂量组)均能够抑制 4种细胞，抑制率随着浓度增大而增大。见表1。

表1 松茸多糖对 U87、HeLa、PANC-1、MCF-7细胞活性的影响

2.2 松茸多糖对 U87、HeLa、PANC-1以及 MCF-7细胞周期的影响 U87经 24.04μg/ml、HeLa经19.6 μg/ml、PANC-1经 21.3 μg/ml以及 MCF-7经18.9μg/ml松茸多糖处理 48 h后，细胞周期发生明显的变化，G1、G2期细胞减少，S期细胞增多。与空白对照组相比，松茸多糖处理后，4种细胞 S期细胞分别增多了 11.37%、8.48%、9.36%和 11.11%。表明松茸多糖处理可使 U87、HeLa、PANC-1以及MCF-7细胞阻滞于 S期。

2.3 松茸多糖对 U87、HeLa、PANC-1以及 MCF-7细胞p53 mRNA表达的影响 U87经 24.04μg/ml、HeLa经19.6 μg/ml、PANC-1经 21.3 μg/ml以及 MCF-7细胞经18.9μg/ml松茸多糖处理 48 h后，p53 mRNA的表达结果见图1。显示松茸多糖能够上调 p53 mRNA表达水平，与对照组相比有统计学差异(P＜0.01)。

图1 松茸多糖对 U87、HeLa、PANC-1以及MCF-7细胞 p53m RNA表达的影响

3 讨论

松茸富含粗蛋白、粗脂肪、粗纤维和维生素 B1、B2、维生素 PP等元素[5]，不但味道鲜美，而且还具有益肠胃、理气化痰、驱虫及对糖尿病有独特疗效等功能，是中老年人理想的保健食品[6]。松茸多糖为从松茸中提取的大分子多糖类物质，具有抗肿瘤、保肝和免疫佐剂以及对环磷酰胺诱发损伤的拮抗作用和抗炎活性[7，8]。

诱导肿瘤细胞周期阻滞是抗肿瘤作用的主要机制之一。已有研究表明，许多参与调控细胞周期的蛋白和基因都与细胞周期阻滞密切相关，如肿瘤抑制基因 p53。目前为止，p53基因是研究最透彻、功能最强大的一种抑癌基因，其作为一种转录因子能促进或抑制很多与细胞周期及凋亡相关基因的表达。当 DNA受到损伤时，p53蛋白表达产物急剧增加，可抑制细胞周期进一步运转。一旦 p53基因发生突变，p53蛋白失活，细胞分裂失去节制，则会发生癌变。人类癌症中约有一半是由于 p53基因发生突变失活引起。

本研究显示，松茸多糖能够诱导 U87、HeLa、PANC-1以及 MCF-7细胞生长以及细胞周期的 S期阻滞。其机制可能是松茸多糖通过上调 p53基因诱导细胞周期阻滞从而抑制肿瘤细胞的生长。

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