TIMP-1在哈萨克族食管癌组织中的表达及其意义

王洪江，李 卉，庞作良，陈 艳，姜孝芳，李惠武*

(1新疆医科大学附属肿瘤医院，乌鲁木齐 830011;2新疆医科大学基础医学院科研中心;3新疆医科大学基础医学院生物化学教研室)

基质金属蛋白酶家族(MMPs)属于锌肤酶超家族，能够降解细胞外基质，在肿瘤转移中起正性调节作用。而 MMP组织抑制物(TIMP)为特异性抑制因子，能抑制 MMP的活性，在肿瘤转移中起负性调节作用[1]。2009年 10月 ～2010年 10月，我们采用RT-PCR及 Western blot方法检测 TIMP-1在哈萨克族食管癌组织中表达，并探讨其在哈萨克族食管癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集同期手术切除的新鲜组织标本(包括癌组织及相距 6 cm以上的远端无癌正常组织)48例 ，均为鳞癌，男 33例 、女 15例 ，年龄 37～67岁。临床分期按照国际食管癌会议制定的标准分期，Ⅰ期 1例，Ⅱ期 17例，Ⅲ期 30例;淋巴结转移 31例，无淋巴结转移 17例;高分化 38例，低分化 10例。术前均未做任何放疗和化疗，所有标本取出后做好标记，立即置入液氮中保存。

1.2 RT-PCR法检测 总 RNA提取后，紫外分光光度计检测 RNA纯度(＞1.6)，计算出 RNA浓度;取 RNA产物 1μg进行逆转录，然后用逆转录产物进行目的基因片段的 PCR扩增。GAPDH作为内对照，取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。用凝胶成像系统进行半定量分析，取目的基因条带和 GAPDH条带强度的比值作为目的基因的相对值。

1.3 组织蛋白提取及 Western blot检测 任取 20例标本采用 Western blot法检测 TIMP-1蛋白表达。取 0.01～0.04 g组织加入 10倍体积全细胞裂解液，置匀浆器上进行匀浆。匀浆液冰上裂解 30 min，12 000 r/min离心 5 min，收集上清，测定蛋白含量，-70℃分装冻存。上样总蛋白为 60μg，12%SDSPAGE电泳 3 h，转膜，丽春红 S染色，4℃封闭过夜;TBST洗膜 30 min，加入稀释的一抗山羊抗人多克隆抗体 TIMP-1(1∶50)、兔抗人多克隆抗体 GAPDH(1∶400)，4℃孵育 8 h;TBST洗膜 30 min，与结合有辣根过氧化物酶标记的 IgG抗体(1∶5 000)室温孵育 4 h，TBST洗膜 30 min;加入 ECM洗剂，暗室曝光、显影、定影，对 X胶片扫描保存。

1.4 统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件包，均数比较采用 t检验，率的比较采用 χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TIMP-1 mRNA表达 TIMP-1 mRNA在 48例癌组织中表达阳性率为 100%(48/48)，高于正常组织 79.1%(38/48)。进行半定量分析其表达强度，癌组织 TIMP-1 mRNA为 0.76±0.37，正常组织为0.42±0.37，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图1、图 2。

图1 GAPDH(298 bp)2%琼脂糖凝胶电泳图

图2 TIMP-1(680bp)2%琼脂糖凝胶电泳图

2.2 TIMP-1 mRNA表达与临床病理特征的关系TIMP-1 mRNA表达量与临床参数的关系见表1。显示 TIMP-1 mRNA表达与各临床参数无关(P均 ＞0.05)。在 18例临床早期病例中，癌组织及其远端无癌正常组织 TIMP-1 mRNA表达差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 TIMP-1 mRNA表达与临床病理特征的关系(OD值，±s)

表1 TIMP-1 mRNA表达与临床病理特征的关系(OD值，±s)

分化程度高、中分化 38 0.74±0.35低分化 10 0.84±0.47 ＞0.05浸润深度T1+T2 10 0.81±0.56 T3+T4 38 0.74±0.31 ＞0.05淋巴结转移无18 0.69±0.28有30 0.80±0.31 ＞0.05

2.3 TIMP-1蛋白表达 Western blot检测显示，TIMP-1蛋白在 20例癌组织及其远端无癌正常组织的表达与其 mRNA水平表达基本一致。见图3。

图3 TIMP-1和 GAPDH蛋白表达

3 讨论

哈萨克族食管癌是新疆地区特高发疾病之一[2]，本课题组一直致力于其发病分子机制的研究。肿瘤细胞发生转移必须降解细胞外基质，MMP是降解细胞外基质的重要酶类，能降解细胞外基质的许多成分，包括胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等，在机体的生理、病理过程中如胚胎发育、血管再生及肿瘤浸润和转移过程等发挥着重要作用。研究亦表明，MMPs的活性可被特异的 TIMPs所抑制[3]，MMPs与 TIMPs之间存在着表达量与活性程度的平衡状态。作为其成员之一的 TIMP-1是一种分子量为 28×103kD的糖蛋白，它能与无活性的明胶酶 B形成可逆性复合物，从而较特异地抑制 MMPs活性。当 TIMP-1表达上调时，可抑制 MMPs的产生及活性发挥，使细胞外基质降解明显减少，具有抑制肿瘤侵袭、转移的能力[4]。本研究结果表明，在哈萨克族食管癌癌组织中 TIMP-1的表达高于其远端正常组织。这一结果与董绍安等[5]研究结果一致，提示恶性肿瘤能促使 MMPs过度表达，使其与 TIMPs之间的平衡被打破，基膜被降解，癌细胞发生转移，而TIMP的反馈性过度表达则能阻止 MMPs对细胞外基质的降解。本研究结果表明，在临床早期病例中，TIMP-1的表达在癌组织及正常组织中存在差异，提示 TIMP-1在肿瘤发生的早期就可能开始发挥防止基质降解、抑制肿瘤细胞转移等作用。此外，本研究中 TIMP-1 mRNA水平表达在肿瘤浸润深度、分化程度及淋巴结转移中的差异无统计学意义，但亦有研究表明其表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移有关[6]，这可能是由于所采用的研究方法不同所致。

综上所述，本研究结果提示 TIMP-1高表达在肿瘤发生的早期可能起着阻碍肿瘤细胞浸润和转移作用，其具体的作用机制有待进一步研究。

[1]Tsuchiya Y，Sato H，Endo Y，et al.Tissue inhibitor of metalloproteinase 1 is a negative regulator of the metastatic ability of a human gastric cancer cell line，KKLS，in the chick embryo[J].Cancer Res，1993，53(6):1397-1402.

[2]侯浚，陈志峰，贺宇彤.食管癌的流行病学[J].河北职工医学院学报，2000，17(4):27-29.

[3]Waas ET，Hendriks T，Lome R，et al.Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitors of metalloproteinase-1 correlate with disease stage and survival in colorectal cancer patients[J].Dis Colon Rectum，2005，48(4):700-710.

[4]吴晓英，陈卫昌，沈玉玲，等.MMP-1和 TIMP-1在人胃癌组织中的表达及临床意义[J].江苏医药，2008，34(12):1200-1202.

[5]董绍安，赵景岚，林乐胜.食管鳞状细胞癌组织 MMP-2、9与TIMP-1表达及意义[J].青岛大学医学院学报，2007，43(2):105-107.

[6]王晓兰，李晓莉，陈奎生.MMP-9与 TIMP-1蛋白在食管鳞癌中的表达及其与肿瘤浸润、转移的关系[J].医药论坛杂志，2009，30(8):1-4.