原人参二醇对大鼠阿霉素肾病的保护作用

郝 旭 周 桥 李 聪 卢 颖 仲 芳 郭山脉 王伟铭 陈 楠

原人参二醇(protopanaxadiol，PPD)是从三七总皂苷中提取的高度纯化的有效活性成分，也是人参二醇组皂苷的皂苷元。PPD有20(S)和20(R)两种构型，其中20(S)的活性大于20(R)，大量实验证实20(S)－PPD具有良好的抗癌活性，对多种癌症细胞均有明显抑制作用，并具有抑制肿瘤血管生成、抑制骨髓瘤细胞生长等活性。

众多研究表明，以20(S)－PPD为皂苷元的三七总皂苷对单侧输尿管梗阻肾脏纤维化模型及糖尿病大鼠模型均有显著的肾脏保护作用，可延缓肾脏纤维化［1，2］，体外实验还发现三七总皂苷可抑制肾小管上皮细胞转分化［3］，这些均表明其可延缓肾脏疾病进程。但是作为三七总皂苷有效活性成分之一，20(S)－PPD在肾脏疾病过程中的作用研究尚少。

阿霉素肾病模型能够较好模拟人类慢性肾脏病，在肾脏病的研究领域广泛应用。急性模型类似于人类微小病变性肾小球肾炎，慢性模型类似于人类局灶节段性肾小球硬化，主要表现为肾小球硬化及间质纤维化。本研究利用阿霉素建立慢性肾病模型，旨在初步观察20(S)－PPD在阿霉素肾病大鼠中的肾脏保护作用。

材料与方法

实验动物 清洁级SD雄性大鼠30只，体重180～200g，购自上海交通大学医学院医学动物中心。饲养条件:室温20℃ ～25℃，相对湿度55% ～60%，每2只装一个大鼠笼，每日正常日光照射，保持房间通风、恒温、安静，自由饮水摄食，每日更换垫料。

药物及试剂 盐酸阿霉素购自上海生工，20(S)－PPD粉剂由上海中药创新研究中心提供，纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(COL I)、α平滑肌肌动蛋白(α－SMA)兔抗大鼠一抗购自Sigma公司，免疫组织化学试剂盒购自福州迈新公司。

动物模型制备与分组 30只SD大鼠适应性喂养一周后，随机分为三组:正常对照组、阿霉素模型组、20(S)－PPD干预组，每组10只。阿霉素肾病模型建立中阿霉素用量依据Okasora等［4］的研究，为降低模型死亡率，本研究采用分次注射。因大鼠尾静脉较细，为防止将药液注射至血管外而引起尾部损伤，本研究选取较粗的阴茎静脉进行药物注射。阿霉素组、20(S)－PPD干预组注射盐酸阿霉素首量5 mg/kg，并于注射的第8天追加2.5 mg/kg，使总累积剂量达7.5 mg/kg，对照组注射等量生理盐水。20(S)－PPD干预组于第二次注射阿霉素后给予20(S)－PPD 200 mg/(kg·d)灌胃 8 周。

标本收集 阿霉素肾病模型建立前于清洁代谢笼收集大鼠尿液，－80℃保存;20(S)－PPD灌胃8周后处死大鼠，心脏穿刺取血，离心分离血清，－80℃保存;留取大鼠肾脏组织适量置于10%甲醛固定，用于常规病理染色及免疫组化检查。

检测指标

生化指标 收集大鼠血标本测定白蛋白、血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、三酰甘油及胆固醇，尿标本测定尿白蛋白、尿肌酐、肌酐白蛋白/肌酐比等。

病理形态学检查 留取的肾脏组织标本依次经10%甲醛固定、石蜡包埋、切片厚2 μm，行常规HE染色及Masson染色，观察各组大鼠的肾小球及肾小管间质的组织学改变情况。Masson染色利用Image－Pro Plus 6.0软件进行肾小管间质纤维化程度的半定量分析。

电镜检查 留取的肾脏组织电镜标本依次经过固定、脱水、置换、浸透及包埋，制备成电镜切片，利用PHILIP CM－80透射电镜观察大鼠肾小球足细胞的病变情况。

免疫组织化学检查 采用SP法利用免疫组化试剂盒进行检测。3%H2O2室温孵育30 min以阻断内源性过氧化物酶活性，内源性卵白素－生物素封闭各15 min，血清封闭15 min以阻断非特异性结合。滴加适当浓度的一抗孵育，4℃过夜(FN 1∶200、COLⅠ 1∶100、α－SMA 1∶400);滴加二抗，室温孵育 30 min，DAB显色并根据镜下反应程度双蒸水适时终止反应，苏木素复染、透明、封片。阴性对照组以PBS代替一抗。阳性表达者可见肾小管间质有棕黄色纤维状物质沉积。每张切片在200倍视野下，随机选取5个非重叠、非髓质视野，以Image－Pro Plus 6.0计算机图像分析系统对肾组织免疫组化结果进行半定量分析。为减少不同批次之间的偏差，拍照过程中统一所有参数。

统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件进行分析处理，实验计量结果以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 t检验，P＜0.05为有统计学差异。

结 果

20 (S)－PPD对阿霉素肾病大鼠生化指标的影响 阿霉素组血白蛋白、三酰甘油及胆固醇均显著高于正常对照组(P＜0.01)，BUN较正常对照组也明显升高(P＜0.05)，而SCr较正常对照组无显著性差异;20(S)－PPD组血白蛋白显著高于阿霉素组(P＜0.05)，三酰甘油和胆固醇均显著低于阿霉素组(P＜0.05)，SCr较正常对照组和阿霉素组均无统计学差异(表1)。

与正常对照组相比，阿霉素组尿白蛋白、白蛋白/肌酐比显著性升高(P＜0.01)，尿肌酐也较正常对照组升高(P＜0.05);20(S)－PPD组其尿白蛋白、肌酐及尿白蛋白/肌酐比较阿霉素组显著降低，有统计学差异(表2)。

表1 各组大鼠的血生化结果(n=10)

表2 各组大鼠尿生化结果(n=10)

20 (S)－PPD对阿霉素肾病大鼠肾脏组织学改变的影响 HE染色显示，对照组大鼠肾小球无硬化，肾小球毛细血管袢结构正常，开放良好。肾小管上皮细胞结构正常，排列整齐，管腔未见扩张，间质无明显的炎症细胞浸润。阿霉素组可见肾小球系膜细胞增生，系膜基质增多，毛细血管袢闭锁、皱缩，部分小球可见袢与球囊壁黏连及局灶节段性硬化样改变。病变肾小球周围近曲肾小管可见上皮细胞空泡变性，管腔扩张，部分管腔内可见蛋白管型，肾小管间质可见大量炎症细胞浸润。20(S)－PPD组可见部分肾小球系膜细胞轻度增生，肾小球毛细血管袢基膜轻度增厚。肾小管间质炎症细胞浸润较阿霉素组明显减少，小管上皮细胞排列规整，小管结构基本正常，管腔内管型少见。

Masson染色正常对照组仅有少量胶原分布于肾小球及肾小管基膜，间质未见明显胶原沉积。阿霉素组可见肾间质明显增宽，大量胶原蛋白沉积，纤维化明显。20(S)－PPD组纤维化程度较阿霉素组明显减轻，具有统计学差异(图1，2)。

图1 20(S)原人参二醇作用下阿霉素肾病大鼠的肾脏病理改变(Masson，×400)

图2 20(S)-PPD对阿霉素肾病大鼠肾间质纤维化半定量分析的影响

20 (S)－PPD对阿霉素肾病大鼠肾小球足细胞的影响 电镜结果显示，对照组肾小球足细胞足突结构正常，呈齿梳状，排列整齐，足突宽度为0.2～0.4 μm，未见明显足突融合;阿霉素组可见肾小球足细胞足突广泛弥漫性融合，节段肾小球足细胞脱落及裸露的基膜，未见结构正常的足突结构;20(S)－PPD组肾小球足细胞结构基本正常，节段肾小球足细胞足突的轻度融合，足突宽度达1～2 μm(图3)。

20 (S)－PPD对阿霉素肾病大鼠肾组织内α－SMA、COL I及 FN 表达的影响 α－SMA、COL I及FN三者均为肾脏纤维化指标，正常情况下在肾脏有少量分布，而在阿霉素组大量分布于肾小管间质(图 4－6)。Image－Pro Plus 6.0 软件半定量分析示，对照组α－SMA、COL I、FN 有基础表达，在阿霉素组三者表达量显著高于正常对照组(P＜0.01)，而20(S)－PPD组较阿霉素组三者表达均显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图3 各组大鼠肾小球足细胞变化(EM，×7400)

图4 各组大鼠肾组织α-SMA的表达及半定量(IHC，×200)

讨 论

图5 各组大鼠肾组织I型胶原的表达及半定量(IHC，×200)

图6 各组大鼠FN的表达及半定量(IHC，×200)

20 (S)－PPD是人参二醇组皂苷的皂苷元，对多种肿瘤如肝癌H22、Lewis肺癌及黑色素B16细胞株的生长均具有明显抑制作用［5］;可能通过抑制肿瘤新生血管形成，减少肿瘤血液供应，使其增生活性下降，从而抑制肿瘤细胞生长［6］。此外，以20(S)－PPD为皂苷元的原人参二醇组皂苷(panaxadiol saponins，PDS)具有显著的肾脏保护作用。已有研究表明适量的PDS可促进正常培养和急性缺血－再灌注肾损伤性兔血清处理后的人肾小管细胞增生［7］。韩国学者研究发现，PDS可下调高糖诱导大鼠的肾小球系膜细胞FN表达。但对于20(S)－PPD在肾脏方面的作用研究较少。

本研究利用20(S)－PPD干预阿霉素肾病模型，观察其肾脏保护作用并初步探讨其作用机制。本研究发现于阿霉素注射后8周，阿霉素组大鼠出现明显的蛋白尿，尿白蛋白/肌酐比较正常对照组显著升高，血白蛋白明显下降，而血脂升高显著，差异具有统计学意义，呈明显的肾病综合征的表现。肾脏常规病理显示阿霉素组，肾小球及肾小管间质损伤严重，主要表现为肾小球的局灶节段性硬化及间质纤维化，而20(S)－PPD组肾小球及间质损伤较阿霉素组明显减轻。可见20(S)－PPD对阿霉素肾病大鼠在生化指标及肾脏病理均具有明显的保护作用。各组大鼠肾小球足细胞电镜结果显示阿霉素肾病大鼠足细胞损伤严重，部分可见足细胞的脱落及裸露基膜，而20(S)－PPD组肾小球足细胞结构基本正常。因此，20(S)－PPD对阿霉素肾病大鼠的肾脏保护作用可能是通过其保护肾小球足细胞损伤，减少蛋白尿，改善肾功能而发挥作用的。

细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)聚集是肾脏纤维化的主要病理特征［8］。转化生长因子β1(TGF－β1)在肾小球及肾小管间质纤维化形成过程中发挥重要调节作用［9］，通过自分泌和旁分泌方式作用于单核细胞和成纤维细胞，促进细胞因子及ECM的表达和分泌并减少ECM的降解，从而促进肾脏纤维化［10］。众所周知，肌成纤维细胞的形成、增生是肾小管间质纤维化的重要病理生理过程。多种疾病的刺激使TGF－β1表达上调，进而下调细胞－ECM间连接蛋白的表达，细胞极性消失，并发生表型 转 化，即 上 皮－间 质 转 分 化 (epithelialmesenchymaltransition，EMT)，该过程的主要标志性蛋白为α－SMA［11］。目前普遍认为肾脏纤维化的程度与间质 α－SMA的表达水平呈正相关。FN和COL I在间质聚集，是ECM代谢失衡时促使肾脏纤维化的重要因素之一。功能研究表明，FN及其受体在介导细胞间黏附、迁移、及信号转导过程中发挥重要作用［12］。在肾脏纤维化过程中，肾小管上皮细胞通过整合素跨膜受体与FN结合，引起细胞膜功能的改变，进而推进 EMT进程［13］。体外实验证实20(S)－PPD衍生物通过丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPK)途径抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞fibronectin的表达［14］。在胶原成分中，COL I的表达是由 TGF－β1下游smad3、smad4分子与COL IA1/2相互作用引发基因转录来调控的［15］。此外其在维持肾小球的正常形态及功能上也发挥了重要作用。本研究免疫组化结果显示，阿霉素组大鼠肾组织间质 α－SMA、FN及COL I的表达显著高于对照组，而20(S)－PPD组间质α－SMA、FN和COL I的表达显著低于阿霉素组。上述结果表明20(S)－PPD可以通过减少ECM的聚集而缓解间质纤维化的发展，进而发挥肾脏保护作用。

综上所述，20(S)－PPD对阿霉素肾病大鼠模型有显著的肾脏保护作用，可能与其保护肾小球足细胞损伤，减少蛋白尿，进而延缓肾小管间质损伤密切相关。而其抗间质纤维化的具体分子机制尚需及进一步研究。

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