前列舒通胶囊治疗慢性前列腺炎模型大鼠脊髓背角中降钙素基因相关肽表达的改变*

陈瑾歆 李云祥 王安果 张宗平 川北医学院生物化学教研室(南充 637000)

慢性前列腺炎(Chronic prostatitis,CP)疼痛是其最主要的症状,因对其痛因至今尚无满意的解释,治疗相当棘手 ,严重影响着患者的生活质量。西医改善疼痛症状效果不明显,中成药常有较好的疗效,前列舒通胶囊(保定步长天浩制药有限公司,国药准字 Z20027140)能较好改善 CP的临床症状 ,中药治疗 CP分子机制尚不明确,本文采用不同剂量前列舒通治疗慢性前列腺炎症大鼠,检测模型大鼠脊髓背角中 CGRP的表达的表达,探讨前列舒通治疗慢性前列腺炎的分子机制。

1 材料和方法 1.1主要试剂和仪器 RN A抽提纯化试剂盒 ,TaKaRa Ex Taq HS酶,RT试剂盒 ,DNaseⅠ (大连宝生物生物技术有限公司),实时定量检测扩增仪 (Bio-RAD,USA)。

1.2 动物模型的分组和制备 3月龄雄性 SD大鼠 40只,完全随机选取 8只为正常对照组 ,其余 32只为实验组,实验组在大鼠前列腺侧叶注射完全弗氏佐剂 20μL制备慢性前列腺炎动物模型,正常对照组注射等量生理盐水,术后 20d实验组大鼠完全随机分为炎症组、前列舒通治疗高、中、低剂量组(n=8),每组大鼠经灌胃给药,前列舒通高、中、低剂量组给药剂量为 0.84g/kg、0.42g/kg、0.21g/kg,1次 /d。正常对照组、炎症组给予相应体积蒸馏水。

给药第 30天于末次给药 24h后处死,纵行剖开椎管显露脊髓,在解剖显微镜下取出 L5-S2脊髓背角组织备用。同时取前列腺组织作 HE染色观察组织的水肿、血管密度、白细胞数量和作甲苯胺蓝染色观察组织的肥大细胞密度鉴定前列腺炎症。

1.3 cDN A第一链的合成 将 1.2取出的脊髓背角组织抽提总 RNA,加入 DNaseⅠ处理总 RNA去除基因组 DNA,取约1.5 μg总 RNA为模板合成 cDNA,-20℃储存备用。

1.4 引物和探针的设计 根据 Genbank中大鼠 CGRP和GAPDH基因序列用 Primer Express 3.0软件设计适用于 FQRT-PCR反应的特异引物和探针,由大连宝生物生物技术有限公司合成。CGRP-F:5'-GTTGTCAGCATCTTGCTCCTGTA C-3'CGRP-R:5'-CAGCCAGTAGGCGAGCT TCTT-3'CGRPP:5'-fam-CGGCCTCCAGGCAGTCCCT TTG-tamra-3'。GA PDH-F:5'-GCAAGGAT ACTGAGCAAGAGAGA-3'GAPDH-R: 5'-CCAGGCCCCTCCTGTTGT-3'GAPDH-P: 5'-fam-AGTCCCCATCCCAACTCAGCCCC-tamra-3'。

1.5 实时荧光 PCR(FQ-PCR)在实时检测扩增仪(Bio-RAD,USA)上扩增并检测荧光,每个样本重复 3次,反应体系25μL:10× PCR buffer2.5μL,2.5mM dNT P mixture2μL,25mMMgcl2 4μL,5U/μL TaKaRa Taq 酶 0.5μL,20pmol/μL荧光探针 0.3 μL,CGRP的特异上下游引物(10pmol/μl)各1μL,cDN A摸板 2μL,去离子水补足 25μL。内参照 GAPDH的反应体系同。反应条件:95℃ 变性 5min;以 94℃ 30S,60℃1 min同时检测荧光进行 40个循环。以每个样品 CGRP和GAPDHCt值的比值作为 CGRP的表达水平,比值越小,CGRP的表达水平越高。

2 结 果 不同组别模型大鼠 CGRP在脊髓背角中的表达 CGRP和 GAPDH RT-PCR荧光扩增曲线均呈典型的“S”型,CGRP mRNA的表达见表 1,结果显示实验组大鼠脊髓背角中 CGRP mRNA表达显著增高(P＜0.01)。

附表 模型大鼠脊髓背角中 CGRP mRNA表达(CGRP/GAPDH,±s,n=8)

附表 模型大鼠脊髓背角中 CGRP mRNA表达(CGRP/GAPDH,±s,n=8)

▲与对照组比较 P＜0.05,△与炎症组比较 P＜0.05◇与低剂量组比较 P＜0.05

Group 正常对照组 炎症组 高剂量组 中剂量组 低剂量组CGRP/GAPDH 1.198± 0.021 1.133± 0.008▲ 1.157± 0.008▲△◇ 1.152± 0.010▲△◇ 1.140± 0.008▲

3 讨 论 L5-S2脊髓背角是前列腺组织感觉信息的初级传入中枢,在前列腺炎性信息的传递和整合过程中有着重要作用[1]。近年来的研究表明,炎症刺激可使脊髓背角表达、释放CGRP增多[2],脊髓背角中 CGRP的释放及其受体的激活是伤害性感受信息传递和调控过程中一个重要的环节[3]。 CGRP是目前公认与疼痛等伤害性信息传导密切相关的神经递质,参与痛觉信息传递及痛觉过敏的形成[4]。Pontari M A等[5]认为神经生长因子 (nerve growth factor,NGF)在 CP疼痛产生、发展中起重要作用,我们以前的实验研究也证实,CP大鼠前列腺组织中 NGF表达增加。而炎症时局部 N GF含量的升高可以上调脊髓背角中 CGRP的表达[6],在病理性疼痛特别是慢性疼痛的发生机制中起重要作用。因此,我们推测 CGRP可能直接或与NGF协同参与了 CP疼痛的发生和维持。

前列舒通胶囊主要成分是黄柏、赤芍、土茯苓、马鞭草、虎耳草、马齿苋、川芎、川牛膝、柴胡、当归、泽泻、甘草等。可清热利湿,化瘀散结,治疗慢性前列腺炎有明显的临床疗效,但为中医辨证经验治疗,分子机制尚不明确。本实验采用荧光定量PCR技术检测不同剂量前列舒通治疗慢性前列腺炎症大鼠大鼠脊髓背角中 CGRP的表达,结果显示慢性前列腺炎炎症组、前列舒通治疗高、中、低剂量组大鼠前列腺组织中 CGRP的表达比正常对照组明显增高;前列舒通胶囊治疗的各组大鼠CGRP的表达均较炎症组降低,其中高、中剂量组降低更明显,低剂量组与炎症组无明显差异,高剂量组和中剂量组 CGRP的表达无明显差异,这提示 CGRP的高表达在慢性前列腺炎发病发展中可能有重要作用。前列舒通可能通过降低 CGRP的表达改善、治疗慢性前列腺炎。

4 结 论 CGRP mRNA在慢性前列腺炎疼痛模型大鼠脊髓背角中的表达明显增高,在慢性前列腺炎疼痛和持续状态中可能有重要作用,前列舒通胶囊可降低炎症大鼠 CGRP的表达,改善其临床症状。

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