电针配合益髓汤对铝中毒运动神经元病模型兔脑脊液中谷氨酸的影响*

王孟琳 王瑞辉 王婧锦 张 红 徐 倩 吴世卫 陕西中医学院(咸阳 712046)

运动神经元病是是一组选择性侵犯运动神经元的慢性进行性变性疾病。它的主要病理改变是选择性地损伤运动神经元(包括大脑皮质运动神经元、脑干运动神经核和脊髓前角运动神经元等)。起病隐袭,持续进展,致残率与死亡率极高。目前为止,本病的病因及发病机制仍不清楚,亦无有效治疗手段。既往研究提示,中医药多样化的综合治疗手段可能为本病带来希望。临床实践证明:中医药治疗本病疗效较为满意,安全无毒、副作用小,但对其实验报道还是较少。为了更深入地探讨中医药治疗运动神经元病的有效性和作用机理,我们采用比色法测定铝中毒运动神经元病模型兔脑脊液中谷氨酸(Glu)水平,研究电针配合益髓汤对铝中毒运动神经元病模型兔脑脊液中兴奋性谷氨酸的影响作用,探讨中医药治疗运动神经元病的疗效与机理,为临床推广应用,提供可靠的依据。现将实验结果报道如下。

1 材料与方法 1.1动物与药物购置成年健康日本大耳白兔 50只(体重 2.5±0.5kg),雌雄各半;由第四军医大学实验动物中心提供,批号为 SCKX(陕)2008-008。适应性饲养 3d后,随机分成 5组:空白对照组、模型对照组、电针治疗组、中药治疗组和电针配合益髓汤治疗组,每组 10只。中药益髓汤组成中的党参、白术、黄芪、炙草、熟地黄、补骨脂、菟丝子、牛膝、川断、枸杞、当归、白芍、鸡血藤、龟甲、鹿角霜等药物均购自陕西中医学院附属医院中药房,组方配制煎熬后,装袋冷藏备用;谷氨酸比色试剂盒、723可见分光仪等均购自武汉博士德生物技术工程公司,方法按说明书操作。

1.2 制作病理模型参考改良的曾氏法造模。模型对照组、电针治疗组、中药治疗组和电针配合中药治疗组 4组实验动物均采用铝中毒复制模型;即在大白兔的项背部每日注射 2.5%氯化铝溶液 1mL/kg,1次 /d,连续 25d;制作成铝中毒所致的运动神经元病理模型。空白对照组则注射等量 0.9%生理盐水,1次 /d,共 25d。经观察用药后大白兔行为动作及肢体表现,如出现行走困难、肢体震颤、口角流涎等现象 ,视为造模成功。

1.3 治疗方法 造模成功后开始治疗,空白对照组大白兔每日定时抓拿 1次,不作任何治疗。模型对照组可每日注射适量生理盐水;针刺治疗组大白兔进行穴位电针治疗,取穴根据《实验针灸学》与《中国兽医针灸学》结合定位。电针选用疏密波,频率在 18-20Hz,电压为 1.5V;取穴主要有足三里、髀关、伏兔、解溪、肩、曲池、合谷、悬钟、阳陵泉、脾俞、肝俞、肾俞、大椎。各穴可交替选用,连续治疗 5d,停 2d,在作下 1疗程,连续 5个疗程。中药治疗组采用益髓汤灌胃治疗,每日 2次,分早晚各1次。连用 5d,停 2d,在作下 1疗程 ,连续 5个疗程。针药配合治疗组采用电针联合服用中药益髓汤,针药并用 ,综合治疗,连续5个疗程。

1.4 标本取材 分别于第 5疗程结束后,将 5组受试兔按 3.5mL/kg标准腹腔注射 10%水合氯醛进行麻醉,然后采取脑脊液。即先将受试兔头颈交接处毛发剔除,暴露皮肤,以手指按压寻找其枕骨粗隆,在该粗隆下确定受试兔颅后窝凹陷的位置。先以碘伏和 75%医用酒精消毒此处,将准备好的 5mL注射器从此处缓缓直刺入皮下,当针下有落空感时,再向兔头方斜刺5mm左右,使针尖进入受试兔枕大池。此时轻轻抽吸注射器,可见淡黄色、清亮、透明的脑脊液缓缓被吸出,若注射器抽吸困难,则对刺入的角度和深度作微小调整,切不可深刺,以免损伤受试兔的延髓组织。每只采集新鲜脑脊液 0.5～ 1mL,立即置于液氮中冻存备检。

1.5 样本测定脑脊液中谷氨酸含量的测定按谷氨酸比色法试剂盒说明书操作。即先处理采集的每份标本,然后用 723可见分光光度计测得各管吸光度 A1、A2值 ,再计算出其谷氨酸浓度;主要操作步骤:①前处理:取 0.2mL脑脊液加 0.6mL试剂一充分混匀,3000～ 3500转 /min,离心 10min,取上清 0.5mL待测。②将试剂二、三、四和蒸馏水分别按 1.0×(n+ 4)、0.1× (n+4)、 0.01× (n+4)、 0.39× (n+4)的比 例配制好混合试剂(n:样本数)。③分别在空白管、标准管和测定管中加入 1.5mL混合试剂,再在空白管、标准管和测定管中分别加入蒸馏水、200 μmol/L谷氨酸标准应用液、待测上清液各 0.5mL。混匀,340nm处,1cm,光径,蒸馏水调零,测各管吸光度 A1值。然后各管均加入试剂五 0.02mL。混匀,37℃水浴 40min,取出后于 340nm处,1cm,光径,蒸馏水调零,测各管吸光度 A2值。④按照计算公式算出谷氨酸含量值。即:谷氨酸浓度(μmol/L)=(测定管 A2值-测定管 A1值)-(空白管 A2值-空白管 A1值 )(标准管 A2值-标准管 A1值)-(空白管 A2值-空白管 A1值 )=标准浓度 (200μmol/L)×样本测试前稀释倍数(4)。

1.6 统计处理各观测指标均采用 SPSS统计软件进行统计学分析处理。脑脊液含量测定结果以±s表示,各组间比较采用 t检验 ,P＜ 0.05为统计学上差别有显著性。

2 结果与结论 2.1结果 各组大白兔检测的脑脊液中谷氨酸含量(单位:μmol/L)结果如下表所示:

附表 各组动物脑脊液谷氨酸含量检测统计结果(±s,μ mol/L)

附表 各组动物脑脊液谷氨酸含量检测统计结果(±s,μ mol/L)

注:与空白组比较,△表示 P＜0.05;与模型组比较,▲P＜0.01.

组 别 n 谷氨酸含量空白对照组 9 35.54± 8.51模型对照组 8 55.83±21.48△中药治疗组 9 38.75± 6.94▲电针治疗组 8 37.86± 9.71▲针药配合组 8 36.97± 6.57▲

附表可见:模型对照组与空白组对照比较,脑脊液谷氨酸含量表达明显升高(P＜0.05);治疗后,电针治疗组、中药治疗组和针药配合治疗组脑脊液谷氨酸含量均较模型对照组明显降低(P＜0.05);电针治疗组、中药治疗组、针药配合组组间比较无显著性差异(P＞0.05)。

2.2 结论检测结果显示:模型对照组脑脊液中谷氨酸含量明显升高,而电针治疗组、中药治疗组和针药配合治疗组脑脊液中谷氨酸含量明显低于模型对照组,尤其是针药配合治疗组脑脊液中谷氨酸含量在 3个治疗组中最低,趋近于空白对照组。说明电针和益髓汤对铝中毒运动神经元病模型兔脑脊液中谷氨酸有抑制作用,也证实了电针和益髓汤治疗运动神经元病的有效性,可有效的阻止兴奋性氨基酸的毒性作用。

3 讨 论 祖国医学认为运动神经元病属于“痿症”范畴,中医药治疗具有明显的临床效果。本实验研究也有力的证明了中医治疗运动神经元病的有效性。通过实验结果我们可以看出:电针和益髓汤可降低运动神经元病模型兔脑脊液中谷氨酸的含量,有效的阻止兴奋性氨基酸的毒性作用,缓解了运动神经元的中毒表现。谷氨酸(Glu)是中枢神经系统内重要的兴奋性神经递质,谷氨酸能神经元过度激活及突触间隙中的谷氨酸过多堆积均可通过激活谷氨酸受体对突触后神经元及其组织造成兴奋毒性。谷氨酸兴奋性中毒引起中枢神经运动神经元损伤的作用机制可能与以下因素有关:①突触前膜对兴奋性氨基酸过度释放或摄取异常,导致运动神经元突触间隙内源性兴奋性氨基酸增多;②运动神经元兴奋性氨基酸受体数量、组成的异常。中枢神经运动神经元的选择性损伤可能说明运动神经元 Ca-AMPA KA受体的数量、组成与其他未受累的神经元不同。③钙离子内流与选择性运动神经元损伤有关。目前研究证实无 GluR2表达的 AM PA受体可允许钙离子流入细胞内,而 GluR2在人类的运动神经元低水平表达。另一方面,运动神经元缺乏钙离子结合蛋白的表达,必须依靠线粒体摄取钙离子缓冲细胞内钙离子负荷。故 GluR2可能是 Ca-AM PA KA受体介导选择性运动神经元损伤的中心。④谷氨酸引起神经元 NO合成酶(nNOS)的激活产生过多的 NO和过氧亚硝基(ONOO),对运动神经元造成损伤。总之 ,谷氨酸能产生特殊的神经毒性作用并诱发运动神经元变性。高水平的谷氨酸聚集在神经突触间隙,过度刺激突解后膜细胞,导致过度去极化。而细胞间钙离子水平的持续增高,引起钙离子介导的细胞外分泌。细胞钙离子通道激活后,水解酶增多,产生自由基,细胞渗透肿胀,从而引起细胞溶解。细胞内的谷氨酸释放到细胞外液,作用于邻近的神经元引起进一步的兴奋,形成谷氨酸放大回路。可见,细胞外的谷氨酸、去极化和细胞溶解相互影响延续和加重了神经变性的过程。实验结果提示我们,电针和益髓汤能降低运动神经元病模型兔脑脊液中谷氨酸的含量,可能的作用途径:一是电针和益髓汤阻抑了神经元突触前膜对兴奋性氨基酸过度释放或摄取异常,导致运动神经元突触间隙内源性兴奋性氨基酸减少;二是限制了钙离子的内流,提高了运动神经元与钙离子结合蛋白结合的能力;降低了运动神经元兴奋性氨基酸受体的数量;三是抑制了 NO合成酶的活性,提高了体内的自由基清除剂的能力,清除了对运动神经元有损害作用的自由基;从而降低了脑脊液中谷氨酸的含量,减少了兴奋性氨基酸的毒性。但对其具体的作用机制还需进一步深入研究探讨。

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