血管紧张素转换酶和醛固酮合成酶基因多态性与原发性高血压病的关系研究

龚洪涛，马先林，杜凤和

原发性高血压可引起多种并发症，其发病是遗传与环境因素共同作用的结果。肾素 －血管紧张素 －醛固酮系统(RAAS)是体内调节血压和水、电解质平衡的主要系统，在高血压的发生、发展过程中起重要作用，RAS基因与高血压密切相关［1］。血管紧张素转化酶 (angiotensin conversion enzyme，ACE)是血管紧张素Ⅰ (angiotensinⅠ，AngⅠ)转换为血管紧张素Ⅱ (angiotensinⅡ，AngⅡ)和缓激肽灭活的关键酶;醛固酮合成酶 (CYP11B2)是醛固酮合成的关键酶，是一种线粒体的细胞色素P450氧化酶。对于RAAS基因多态性的研究已成为近年来的热点之一［2－4］，本研究以原发性高血压病 (EH)患者为研究对象，探讨ACE I/D和CYP11B2－344C/T多态性与EH的关系。

1 资料与方法

1.1 病例选择标准 选取2005年6月—2007年1月于我院就诊的汉族高血压患者200例为高血压组，其中男90例，女110例，年龄35～77岁，平均 (53.7±10.6)岁。均符合1999年世界卫生组织/国际高血压协会诊断标准，收缩压≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和 (或)舒张压≥90 mm Hg;调查前2周内服用降压药者及既往曾被诊断为高血压者也被纳入高血压组。排除继发性高血压，严重心功能不全，严重肝、肾功能障碍，3个月内有心肌梗死及脑卒中者，妊娠或哺乳妇女。选择我院同期就诊的正常血压者192例作为对照组，其中男98例，女94例，年龄 (51.6±8.1)岁，均为汉族。收缩压＜140 mm Hg，且舒张压＜90 mm Hg，无服用降压药史，无高血压家族史，对照人群的排除标准与病例排除标准相同。

1.2 人体基本参数测定 测定身高、体质量、血压等，血压测量时静坐10 min，使用标准台式血压计于坐位连续测量3次，每次间隔10 min取其均值。以体质量/身高2计算体质指数 (bodymass index，BMI)。

1.3 生物化学指标测定 抽取空腹静脉血，离心取血清，采用生化分析仪检测空腹血糖、三酰甘油 (triglyceride，TG)、总胆固醇 (total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL－C)及高密度脂蛋白胆固醇 (HDL－C)等指标。

1.4 DNA提取 取冷冻EDTA抗凝全血，水浴解冻，E.Z.N.ATM Blood DNA Kit(OMEGA)试剂盒提取DNA，－20℃保存。

1.5 聚合酶链反应 (PCR)扩增及限制性片断长度多态性(PFLP)ACE I/D PCR引物:上游引物序列:5'－CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT－3'，下游引物序列:5'－GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT－3'。CYP11B2－344C/T PCR引物:上游引物序列:5'－ATGTTGACCACAGGAGGAGAC－3'，下游引物序列:5'－CCAGGGCTGAGAGGAGTAAAATG－3'，反应体系为10μl，包括20 ng基因组DNA 2.0μl，PCR引物 (5 pmol/L)各0.6μl，2×Taq PCR Master Mix 5μl，用灭菌蒸馏水补充至10μl。PCR反应参数:首先95℃变性10 min，随后进行35个循环，每1个循环包括94℃变性30 s，分别在58℃和62℃退火30 s，72℃延伸40 s。最后，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像仪成像。

取CYP11B2－344C/T PCR扩增产物10μl，5 U HaeⅢ内切酶 (美国promega公司生产)，10 ENB缓冲液2μl，加双蒸水补足体积为20μl，37℃温育12 h后，取10μl上述产物，用含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶在电压100 V，1×TAE缓冲液中电泳45 min，凝胶成像系统下观察并保存酶切结果。

1.6 统计学方法 应用SSPS 11.5统计软件包。计量资料采用(±s)表示，计数资料采用百分比表示。遗传平衡检验采用哈代－温伯格 (Hardy－Weinberg)平衡定律。两组间计量资料的比较采用t检验，计数资料的比较采用χ2检验;与高血压相关的影响因素分析采用多元Logistic回归;以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高血压组和对照组一般临床资料比较 两组患者的空腹血糖、TG、HDL－C和LDL－C水平比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05);两组BMI和TC水平比较，差异有统计学意义 (P＜0.01，见表1)。

2.2 ACE I/D多态性与高血压的关系

2.2.1 基因型频率和等位基因频率分布比较 I等位基因扩增产物为490 bp，D等位基因扩增产物为190 bp，共得到II、ID和DD 3种基因型。高血压组和对照组Ⅱ、ID和DD基因型频率分布均符合Hardy－Weinberg平衡 (P＞0.05)，说明达到了遗传平衡，具有群体代表性。两组基因型和等位基因频率差异均有统计学意义 (P＜0.05，见表2)。

2.2.2 多元Logistic回归分析 本研究用高血压为因变量，以年龄、BMI、空腹血糖、TG、TC等心血管病危险因素及基因型作为自变量，进一步采用多元Logistic回归模型分析了ACE I/D基因多态与高血压患病风险的关联是否独立于其他传统的心血管病危险因素 (见表3)。校正了传统危险因素的影响后，ACE DD基因型的携带者患高血压的危险性显著增加 (P=0.003)，OR值为3.66〔95%CI(1.54，8.69)〕。

表1 高血压组和对照组临床资料比较Table 1 Comparison of clinical data between EH group and control group

表2 高血压组和对照组ACE I/D基因型和等位基因频率分布〔例(频率)〕Table 2 Freqencies of ACE I/D genotypes and allele between EH and control group

表3 Logistic回归分析ACE I/D多态性与EH的相关性Table 3 Logistic regression analyze the association of ACE I/D polymorphism and EH

2.3 CYP11B2－344C/T多态性与高血压的关系

2.3.1 CYP11B2－344C/T多态性 CYP11B2－344C/T位点PCR扩增产物为273 bp片段，若扩增片段中存在C－344T碱基替换，则产生限制性内切酶HaeⅢ位点 (GG/CC)，TT基因型的扩增片段不存在HaeⅢ酶切位点，出现一个273 bp片段;CC基因型存在HaeⅢ酶切位点，将出现214 bp和59 bp两个片段;TC基因型则产生273 bp、214 bp和59 bp 3个片段。

2.3.2 基因型频率和等位基因频率分布比较 CYP11B2－344C/T的基因型频率在高血压组和对照组的分布均符合Hardy－Weinberg平衡 (P＞0.05)，说明达到了遗传平衡，具有群体代表性。高血压组基因型与等位基因频率与对照组比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表4)。

表4 高血压组和对照组CYP11B2－344C/T基因型和等位基因频率分布〔例 (频率)〕Table 4 Freqencies of CYP11B2－344C/T genotypes and allele between EH and control group

3 讨论

ACE基因I/D多态性存在于自然人群中，其等位基因及各基因型的分布有明显的种族和地区差异，白种人ACE基因的D等位基因频率为0.562，黑人为0.603，亚洲人为0.39［5］。本研究中，正常对照组192例汉族人D等位基因频率为0.37，与报道较为接近。近年来关于ACE基因I/D多态性与EH的关系的研究报道不尽相同。一项对684名志愿者进行6年的队列研究，其中DD基因型225例，高血压42例，高血压患病率为18.3%;ID基因型335例，高血压16例，高血压患病率为4.7%;Ⅱ基因型124例，高血压2例，高血压患病率为1.6%，表明ACE基因DD基因型与高血压的发生相关［6］。Barbalic等［7］通过多元 Logistic回归分析，引入模型的危险因素有性别、年龄、肥胖指数、TG、TC，最后发现DD基因型携带者发生高血压病的危险是Ⅱ基因型携带者的2.5倍〔95%CI(1.19，5.25)，P=0.02〕。而 Jeunemaitre 等［8］和Harrap等［9］研究认为ACE基因与高血压无关。

本研究发现，ACE基因I/D各基因型在EH患者和正常人群之间有显著差异，高血压组和对照组DD基因型频率分别为0.28和0.12，前者明显高于后者。用多元Logistic回归模型校正了传统危险因素的影响后，ACE基因DD基因型的携带者患高血压的危险性显著增加，OR值为3.66〔95%CI(1.54，8.69)〕，进一步证实了DD基因型与EH的相关性。ACE基因I/D多态性显著影响了血浆和细胞的ACE水平，DD型最高，ID型次之，Ⅱ型最低，因而推测等位基因D在ACE基因表达调控中起活化作用，而等位基因I起抑制作用。因而DD纯合子血浆中ACE水平较高，导致血液循环和器官组织内AngI转化率升高，AngⅡ生成增多，影响机体内水钠代谢平衡、醛固酮的分泌、血管收缩和血管平滑肌增殖。这均是导致心血管疾病尤其是高血压发病的关键因素。

CYP11B2基因与EH关系目前多限于－344C/T多态性的研究，不同种族－344C/T多态性分布不同，日本正常人群T和C等位基因频率分别为0.68和0.32［10］，高加索白人正常人群T和C等位基因频率分别为0.53和0.47［11］。本研究中，汉族正常人群T和C等位基因频率分别为0.74和0.26，与日本人接近。Tamaki等［10］研究表明，TC+CC基因型在正常人中明显低于高血压患者，在EH患者中TC+CC基因型与高醛固酮血浆肾素活性比率 (ALD/PRA)明显相关，并且在动态血压监测中TC+CC基因型患者血压明显高于TT基因型者，因此认为醛固酮合成酶基因T(－344)C多态性是低肾素高血压的一个遗传标志。Pojoga等［12］研究表明，醛固酮合成酶基因T(－344)C多态性中C等位基因与血浆醛固酮水平明显相关，但研究结果T(－344)C多态性与高血压无关。Tsujita等［13］在日本人群中研究未发现醛固酮合成酶基因T(－344)C多态性与高血压有相关性。本研究结果显示，高血压组基因型及等位基因频率与对照组相比均无显著差异，说明CYP11B2基因－344T/C多态性与我国汉族人群EH发生无相关性。

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