二烯丙基二硫对人胃癌细胞维甲酸相关孤核受体α表达的影响

石 莺，黄建军，唐章文，谭亚丽，吉晓霞，凌 晖，苏 琦

二烯丙基二硫 (diallyl disulfide，DADS)是大蒜中主要的脂溶性成分。DADS处理肿瘤细胞后，肿瘤细胞结构及形态学表现有明显的向正常细胞分化的趋势［1］。进一步运用蛋白质组学技术研究发现，DADS处理人胃癌MGC803细胞前后，有24种蛋白表达出现变化［2］，其中表达显著上调的维甲酸相关孤核受体α(RORα)在DADS诱导MGC803细胞分化过程中的作用机制不明。RORα在调节体内多种组织细胞的发育和(或)分化以及对抗疾病的发生发展过程中发挥重要作用［3］。有研究显示，RORα具有抑制前列腺癌细胞［4］、结肠癌细胞［5］、乳腺癌细胞［6］增殖的作用，但是 RORα与胃癌的关系尚不清楚。故本研究通过观察DADS对体外培养的人胃癌SGC7901(中分化腺癌)细胞与MGC803细胞形态结构的影响，观察DADS处理前后人胃癌细胞中RORα蛋白表达的差异，探讨DADS诱导人胃癌细胞分化的分子机制以及RORα与胃癌发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 SGC7901、MGC803细胞由中南大学湘雅医学院细胞中心引进。DADS为Fluka公司产品。核蛋白抽提试剂盒GK5112为上海捷瑞生物公司产品。BCA蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品，RT－PCR逆转录试剂盒为Promega公司产品，总RNA提取试剂盒为美国Omega公司产品，均购于华美生物工程公司。兔抗人RORα多克隆抗体购自Santa Cruz公司，羊抗兔二抗购于武汉博士德生物公司。其他常规的化学用品、新生牛血清、RPMI－1640培养基均购自长沙瑞晶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 所有细胞用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养于37°C，含体积分数为5%二氧化碳(CO2)的恒温培养箱中培养。取对数生长期细胞，按所需浓度接种于培养瓶或培养板内，待6～8 h细胞完全贴壁后，加用或换用含有药物的培养液，培养至预定时间。本实验中采用30 mg/L DADS浓度作为MGC803处理组的浓度。

1.2.2 形态学观察 利用倒置显微镜对活细胞在接触处理因素前后细胞形态学及生长状况的变化进行动态观察。制备细胞爬片，常规HE染色于镜下观察处理前后细胞形态学的改变。

1.2.3 免疫细胞化学染色 制备细胞爬片，预冷丙酮室温固定10 min，自然风干，4°C冰箱保存。SP法常规检测，滴加抗体前，切片经高压处理，修复暴露抗原。以PBS代替一抗作阴性对照，DAB显色。

1.2.4 间接免疫荧光流式细胞术 常规消化收集细胞，1 000 r/min，离心5 min，计数制成1×109/L×1 ml的单细胞悬液。加4%多聚甲醛1 ml固定细胞，4°C冰箱保存备用。用PBS洗涤离心2次，洗掉固定液，将细胞混匀，加细胞打孔剂0.1% ～0.2%Triton－X 100 1 ml，冰上孵育10 min，PBS洗涤离心2次，分装成两个体积基本相等的EP管;加50μl一抗(或PBS代替一抗作为阴性对照)，冰上孵育30～45 min;PBS洗涤离心2次，弃上清液;加50μl荧光标记的二抗 (FITC－二抗)冰上孵育30～45 min;PBS洗涤离心2次，弃上清液;用剩余的PBS重悬细胞，1%多聚甲醛0.5 ml细胞固定，上机检测，流式细胞仪分析荧光强度。

1.2.5 半定量RT－PCR

1.2.5.1 引物合成 利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，送交上海生物工程服务技术有限公司合成，引物序列如下所示:β－actin:上游引物:5'－TCTACAATGAGCTGCGTGTGG－3'，下游引物:5'－GGAACCGCTCATTGCCAATG－3'(496 bp);RORα:上游引物:5'－GTCAGCAGCTTCTACCTGGAC－3'，下游引物:5'－GTGTTGTTCTGAGAGTGAAAGGCACG －3'(482 bp)。

1.2.5.2 细胞总RNA提取 采用美国Omega公司总RNA提取试剂盒 (E.Z.N.A Total RNA Midi Kit，product#R6693)提取，按照试剂盒说明书步骤操作。1%的琼脂糖凝胶电泳观察，并用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度。

1.2.5.3 反转录 按照RT－PCR试剂盒说明书合成第一链cDNA。PCR体系中含有cDNA 2μl，2×Taq PCR Master Mix(0.1 U Taq DNA Polymerase/ml，500 mmol/L;dNTP each，50 mmol/L;pH 8.7的Tris－HCl;20 mmol/L KCl;4 mmol/L MgCl2)10 μl，上游引物 (10 pmol/μl)0.5 μl，下游引物(10 pmol/μl)0.5μl，加无核酸酶的水至终体积为20μl。优化的PCR反应条件为:95°C预变性10 min;94°C变性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸30 s，30个循环;72°C最终延伸10 min。反应结束后取5μl产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测，用UV观察EB染色条带并照相。

1.2.6 Western blot检测 用含10%胎牛血清的RPMI－1640培养液培养人胃癌细胞，待细胞生长至对数生长期时，用30 mg/L DADS处理MGC803细胞8、12、24 h后收集细胞，根据核蛋白抽提试剂盒提取核蛋白;BAC法进行蛋白定量。10%分离胶，以每孔50μg的蛋白量加样，进行SDS－PAGE电泳。将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，转移条件为4°C，恒压100 V，3 h。5%脱脂奶封闭4°C过夜。一抗 (1∶1 000)37℃孵育2 h，二抗37°C孵育1 h。于暗室中曝光，显影、定影。胶片用薄层扫描仪进行灰度扫描，分析各产物的灰度值(V值)，将各V值与对应标本的Vβ－actin相比，计算出样本蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件包进行数据处理。计量资料以 (x－±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学观察结果 MGC803细胞体积大，细胞质相对少，细胞核大，染色深，核仁明显，可见核分裂象;DADS处理24 h后，细胞大部分变成梭形或小圆形，细胞稀疏，核变小，染色变淡，核仁数量减少，核质比减小。SGC7901细胞呈多边形或不规则形，细胞致密，甚至堆积为复层，可见瘤巨细胞，核质比例大，核大、深染，核仁多个，可见核分裂象，细胞大小不一，异型性明显;DADS处理24 h后，细胞皱缩、变圆，体积变小，核仁少见，细胞质比例增大，嗜酸性增强，核分裂象少见，细胞间隙明显增大 (见图1)。

2.2 免疫细胞化学检测结果 RORα阳性染色主要位于细胞核，细胞质中也可见少许阳性染色。以PBS代替一抗作为空白对照，DADS处理前RORα在两种胃癌细胞中有弱阳性表达，DADS处理24 h后的SGC7901、MGC803细胞中呈强阳性表达 (见图2)。

2.3 RT－PCR结果 灰度扫描定量分析结果显示，DADS处理24 h后，SGC7901、MGC803细胞中RORα的表达量分别为(1.09±0.01)和 (0.97±0.01)，显著高于对照组的 (0.45±0.03)和 (0.44±0.02)，差异有统计学意义 (t值分别为74.81和64.76，P＜0.01)。实验重复3次。

2.4 Western blot分析 30 mg/L DADS处理人胃癌MGC803、SGC7901细胞8、12、24 h后，RORα蛋白表达量均较未处理组显著上调，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表1、图3)。实验重复3次。

3 讨论

前期工作表明:作为大蒜中主要的脂溶性成分，DADS不仅毒性低，抗肿瘤效果明显，还是一种很有开发潜力的抗肿瘤药物。用大蒜中主要的脂溶性抗肿瘤成分DADS处理肿瘤细胞后，肿瘤细胞结构及形态学表现有明显的向正常细胞分化的趋势［1］;在鉴定DADS处理前后人胃癌MGC803细胞差异表达蛋白的蛋白组学研究过程中发现，DADS处理MGC803细胞后，一些有潜在诱导胃癌细胞分化作用的蛋白如RORα表达显著上调［7］。一系列研究表明，RORα与体内其他生物活性因子协同作用，共同调节细胞的生长、分化与凋亡［8－9］，对多种组织器官的发育起着关键作用。另外，RORα参与生物代谢的调控，在对抗心血管疾病、慢性炎症、免疫功能不全、骨代谢障碍、肿瘤等一些病理过程中发挥重要作用。

本实验利用多种方法观察DADS处理人胃癌细胞前后RORα蛋白表达的变化。发现 DADS处理人胃癌 MGC803、SGC7901细胞24 h后，与对照组相比，两种肿瘤细胞均出现明显的形态改变，提示DADS对人胃癌细胞有抑制增殖并诱导细胞向良性或正常细胞方向发展的作用。免疫细胞化学结果显示，与对照组细胞核内RORα蛋白弱阳性表达相比，DADS处理组细胞核内棕黄色颗粒显著增多，RORα蛋白强阳性表达。RT－PCR反映了 DADS对人胃癌 MGC803、SGC7901细胞RORα核酸水平表达的影响，其结果说明DADS诱导人胃癌细胞RORα编码基因的表达上调。Western blot结果显示，DADS处理人胃癌MGC803细胞8、12、24 h后，RORα蛋白相对表达量较对照组明显上调。

图1 光学显微镜下DADS处理前后人胃癌细胞的形态 (HE染色，×400)Figure 1 Phase－contrastmicrographs of MGC803 and SGC7901 cells treated with 30 mg/L DADS

图2 DADS处理前后人胃癌细胞中RORα的表达 (SP法，×400)Figure 2 Expression of RORαin MGC803 and SGC7901 cells treated with 30 mg/L DADS

表1 DADS作用不同时间对MGC803、SGC7901细胞中RORα蛋白表达的影响 (x－±s，n=3)Table 1 Expression of RORα in MGC803 and SGC7901 cells treated with 30 mg/L DADS for 8 h，12 h and 24 h

图3 DADS处理前后RORα蛋白表达变化Figure 3 Expression of RORαin MGC803 and SGC7901 cells treated with 30 mg/L DADS

综上所述，DADS能诱导人胃癌MGC803、SGC7901细胞RORα蛋白表达上调，RORα可能是DADS作用的潜在靶点，但RORα在DADS抑制人胃癌细胞增殖作用中的具体作用机制还有待于进一步研究。

1 凌晖，张良运，梁晓秋，等.二烯丙基二硫诱导人胃癌MGC803细胞的分化 ［J］．世界华人消化杂志，2005，13(3):294－298.

2 Yao L，Qi S，Jie H，et al.The differential proteomic expression analysis of diallyl disulfide［J］．FEBS J，2005，272:445－445.

3 Jetten AM.Retinoid－related orphan receptors(RORs):critical roles in development，immunity，circadian rhythm，and cellular metabolism［J］．Nucl Recept Signal，2009，7:e003.

4 MorettiRM，MarelliMM.Activation of the orphan nuclear receptor ROR alpha counteracts the proliferative effect of fatty acids on prostate cancer cells:crucial role of5－lipoxygenase［J］．Int JCancer，2004，112(1):87－93.

5 Lee JM，Kim IS，Kim H，et al.ROR alpha attenuates Wnt/betacatenin signaling by PKC alpha－dependent phosphorylationin colon cancer［J］．Mol Cell，2010，37(2):183 －195.

6 Odawara H，Iwasaki T，Horiguchi J，et al.Activation of aromatase expression by retinoic acid receptor－related orphan receptor(ROR)alpha in breast cancer cells:identification of a novel ROR response element［J］．JBiol Chem，2009，284(26):17711－17719.

7 谭红，常丽丽，高富贵.大葱提取液抗人胃癌作用的细胞周期特点［J］．疑难病杂志，2007，6(2):88.

8 Vincent Giguère.Orphan nuclear receptors:from gene to function ［J］．Endocrine Reviews，1999，20(5):689.

9 许朝，姜藻.PI3K/Akt信号通路抑制剂对胃癌细胞SGC7901中Skp2和NAG－1表达的影响及其效应［J］．中国全科医学，2010，13(5):1557.