rAAV-AsiNOS抑制C6胶质瘤细胞生长的实验研究☆

石松生陈春美杨卫忠王春华王锐金昌丹

rAAV-AsiNOS抑制C6胶质瘤细胞生长的实验研究☆

石松生*陈春美*杨卫忠*王春华*王锐*金昌丹*

目的 探讨携带诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）反义RNA重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体（rAAV-AsiNOS）对胶质瘤细胞生长增殖的影响以及对iNOS和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等表达的影响。方法 根据C6细胞培养基成分不同分为3组，即空白组［含10%胎牛血清的改良Eagle培养基（DMEM）培养液，n＝4］、β-半乳糖苷酶基因（β-galactosidase gene z，lacz）重组腺相关病毒载体（rAAV-LacZ）组（含有rAAV-LacZ的10%胎牛血清的DMEM培养液，n＝4）和rAAV-AsiNOS组（含有rAAV-AsiNOS的10%胎牛血清的DMEM培养液，n＝4），C6细胞生长曲线；3组同时进行培养1、3、6、12、24 h，应用流式细胞仪（FCM）检测C6细胞中NT阳性细胞百分比、iNOS和VEGF阳性细胞百分比，应用半定量反转录聚合酶链式扩增（RT-PCR）分析iNOS和VEGF mRNA表达。结果 一定感染复数的重组病毒载体rAAV-LacZ对C6胶质瘤细胞生长趋势无明显影响，而rAAV-AsiNOS重组病毒载体在转染C6细胞从3d开始出现细胞生长缓慢，与空白组比较差异有统计学意义 （P＜0.05）。FCM检测结果显示，NT、iNOS和VEGF阳性细胞在空白组和rAAV-LacZ组之间差异无统计学意义（P＞0.05），而rAAV-iNOS组从培养6h开始出现NT、iNOS和VEGF阳性细胞百分比下降， NT百分比分别为9.37%± 1.2%，97.3%±0.75%和4.62%±0.53%；iNOS百分比分别为18.42%±2.17%，14.29%±1.44%和 8.31%±1.30%；VEGF百分比分别为7.85%±0.98%，6.32%±0.78%和 5.04%±0.41%，较空白组之间差异均有统计学意义（P＜0.05）；半定量RT-PCR分析结果显示，同一时间中，iNOS mRNA在空白组和rAAV-LacZ组之间差异无统计学意义 （P＞0.05），而rAAV-iNOS组从培养6h开始出现iNOS mRNA表达下降，分别为0.46±0.04，0.34±0.03和0.21±0.03，较同一时间空白组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 携带iNOS反义RNA腺相关病毒载体rAAV-iNOS能够抑制C6胶质瘤细胞生长增殖，能够抑制iNOS表达，从而通过抑制VEGF基因表达发挥抗胶质瘤细胞生长增殖的重要作用。

胶质瘤iNOS 重组腺相关病毒载体 VEGF 细胞增殖

诱导型一氧化氮合酶（iNOS）广泛参与了胶质瘤的血管生成、增殖与凋亡以及化疗耐受等过程，与胶质瘤的发生、发展密切相关［1］。针对iNOS的“靶点治疗”，可能是胶质瘤综合治疗的一条新途径。本实验在前期成功构建了携带iNOS反义RNA的重组腺相关病毒载体（rAAV-AsiNOS）基础上［2］，探讨iNOS反义RNA基因对胶质瘤细胞生长增殖的影响，为胶质瘤治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 研究对象 携带iNOS反义RNA的重组腺相关病毒载体（rAAV-AsiNOS）以及携带半乳糖苷酶基因（LacZ）的腺相关病毒载体（rAAV-LacZ）由我所成功构建［2］，大鼠胶质瘤 C6细胞购自中国科学院上海生命科学研究院。兔抗鼠的硝基酪氨酸（nucleotide，NT）、iNOS、VEGF单克隆一抗体和FITC标志（标记绿色荧光）的羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Trizol试剂盒和RT-PCR kit（二步法）购自 Promega（美国），iNOS引物由上海生物工程公司合成。

1.2 重组腺相关病毒载体对C6细胞生长曲线影响 在24孔板中每孔接种2×103个C6胶质瘤细胞，在含有10%胎牛血清DMEM培养基上培养，待细胞生长50%左右，弃去培养基后，分别换成含有重组腺相关病毒载体 （rAAV-AsiNOS和rAAV-LacZ）的10%胎牛血清DMEM培养基，每孔加入的重组病毒按感染复数 （multiplicity of infection，MOI）100，分别为rAAV-AsiNOS组和rAAV-LacZ组，设立空白组（即10%胎牛血清的DMEM培养液），置37℃，5%CO2条件下培养， 观察形态，共3组，每天从每组取4孔细胞，消化，离心后计数 ，连续观察7 d，绘制细胞生长曲线。

1.3 rAAV-AsiNOS抑制C6胶质瘤细胞的实验

1.3.1 实验分组 在24孔板中每孔接种1×105个C6胶质瘤细胞，在含有10%胎牛血清DMEM培养基上培养，待细胞生长60%左右，弃去培养基后，分别换成含有重组腺相关病毒载体（rAAV-AsiNOS和rAAV-LacZ）的10%胎牛血清DMEM培养基，每孔加入的重组病毒按MOI 100，设立空白组（即10%胎牛血清的DMEM培养液）。置37℃，5%CO2条件下培养1、3、6、12、24 h后，进入下一步实验。

1.3.2 流式细胞仪（FCM）检测NT阳性细胞百分比 收集各组不同培养时间的C6胶质瘤细胞，依次加入稀释好的一抗兔抗鼠的NT单克隆抗体，室温下共孵育30 min，洗涤、离心。加入二抗FITC标志（标记绿色荧光）的羊抗兔IgG，共孵育30 min，离心、洗涤，上机检测。定量分析NT阳性细胞荧光强度和NT阳性细胞绝对数，计算NT阳性细胞百分比。NT阳性细胞百分比＝NT阳性细胞绝对数／（NT阳性细胞绝对数 ＋NT阴性细胞绝对数）×100%。

1.3.3 FCM定量检测iNOS和VEGF阳性细胞百分比 收集各组不同培养时间的C6胶质瘤细胞，依次分别加入兔抗鼠的iNOS、VEGF单克隆一抗体和二抗FITC标志 （标记绿色荧光）的羊抗兔IgG，上机检测，独立重复4次实验，计算阳性细胞百分比。

1.3.4 半定量RT-PCR分析iNOS mRNA 收集各组不同培养时间的C6胶质瘤细胞，用Trizol试剂抽提RNA，计算总RNA浓度，取总RNA 2 μg进行逆转录。再以逆转录反应液2 μL作为模板，加入相应引物（β-actin内参照）进行PCR扩增，总反应体积50 μL。所用引物分别为iNOS（正义链5′-TCGAGCCCTGGAAGACCCACATCT-3′；反义链 5′-GTTGTTCTT CTTCCAAGGTGTTTGCCTTAT-3′），β-actin（正义链 5′-ACTGGCATTGTGATGGACTC-3′；反义链5′-CAGCACTGTGTTGGCA TAGA 3′）。扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸1 min（以上步骤循环35次），最后72℃继续延伸7 min。PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，美国伯乐BIO-RAD Gel DocTM XR凝胶成像系统观察和照相，独立重复4次实验，以β-actin内参照作为内标，与同步产物进行比较，对PCR产物相对定量，应用quantity-one分析软件半定量分析，计算所得产物的积分光密度与各自内参照积分光密度的比值来反映该iNOS mRNA的水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0进行处理，数据以均数±标准差（±s）表示，3组数据进行方差齐性分析后再进行两组间比较，采用q检验分析，检测水准α＝0.05。

2 结果

2.1 重组腺相关病毒载体对C6胶质瘤细胞生长影响 与同一时间空白组C6胶质瘤细胞比较，一定感染复数（MOI 100）的rAAV-LacZ重组病毒载体对C6胶质瘤细胞生长趋势无明显影响，而rAAV-AsiNOS重组病毒载体在转染3 d开始出现C6细胞生长缓慢，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.2 FCM检测NT阳性细胞百分比 FCM检测结果显示，C6胶质瘤细胞在含有重组病毒载体AAV-AsiNOS培养基中培养6 h开始，NT阳性细胞百分比较空白组和AAV-LacZ组的明显下降，并随着培养时间延长百分比下降，二者之间差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

2.3 FCM定量检测iNOS、VEGF和PCNA阳性细胞百分比

定量FCM检测结果显示，空白组和rAAV-LacZ组之间iNOS阳性细胞百分比差异无统计学意义（P＞0.05）；而rAAV-iNOS组从培养6 h开始出现iNOS阳性细胞百分比下降，较空白组之间差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

VEGF阳性细胞空白组和rAAV-LacZ组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；而rAAV-iNOS组从培养6 h开始出现iNOS阳性细胞百分比下降，较空白组之间差异有统计学意义（P＜0.05）（表4）。

2.4 半定量RT-PCR分析iNOS mRNA基因表达水平 所有组别提取的总 RNA的λ值（OD260／OD280）在 1.86至1.97之间，说明总RNA浓度合适，总RNA在2.0%琼脂糖凝胶电泳图显示均可见三条带，表明所提取的RNA未见降解。半定量PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明，iNOS和β-actin mRNA的特异性片段大小分别为276 bp和201 bp。iNOS mRNA在不同组别中均有不同程度表达，其中，同一时间空白组和rAAVLacZ组之间差异无统计学意义 （P＞0.05）；而rAAV-iNOS组从培养6 h开始出现iNOS mRNA表达下降，与空白组同一时间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）（表5，图1～3）。

3 讨论

本课题组在实验前期工作中已经成功地构建了携带iNOS反义RNA基因片断重组腺相关病毒载体（rAAV-AsiNOS）并引入腺相关病毒载体rAAV-LacZ作为对照载体，成功地应用于研究iNOS在脑缺血发病机制作用研究［3］。本实验将这种重组腺相关病毒载体转染C6胶质瘤细胞，与空白组比较，发现一定感染复数的重组病毒载体rAAV-LacZ对C6胶质瘤细胞生长并未产生明显的影响，而转染重组病毒载rAAV-Asi-NOS后C6胶质瘤细胞生长缓慢，说明携带iNOS反义RNA基因片断重组载体能够抑制胶质瘤细胞生长增殖。

将携带正义或反义目的基因片断重组病毒载体转染到靶细胞中，使目的基因在靶细胞中表达特定的功能，或目的基因片断抑制靶细胞特异性基因表达，这就是当前基因治疗的重点研究方向之一［4］。本实验中，将 iNOS基因片断反向克隆到腺相关病毒载体中，构建携带iNOS反义RNA腺相关病毒载体，并将重组载体转染到C6胶质瘤细胞中，抑制C6胶质瘤细胞中iNOS的表达，减少iNOS介导促进肿瘤细胞生长增殖的作用。

表1 C6胶质瘤细胞在不同组别中不同培养时间的细胞数［（±s）×103，n＝4］

表1 C6胶质瘤细胞在不同组别中不同培养时间的细胞数［（±s）×103，n＝4］

1）经q检验分析，与空白组比较，P＜0.05

组别空白组rAAV-LacZ组rAAV-AsiNOS组1 d 2.00±0.00 2.00±0.00 2.00±0.00 2 d 2.74±0.70 2.84±0.83 2.79±0.50 3 d 4.71±0.23 4.54±0.17 4.02±0.761）4 d 7.41±0.25 7.32±0.36 6.11±0.201）5 d 10.77±2.07 10.24±1.28 8.50±0.861）6 d 13.31±2.17 12.97±2.01 9.30±0.491）7 d 19.18±2.24 18.61±2.00 11.34±1.451）

表2 NT阳性细胞百分比在不同组别不同培养时间的变化［±s，n＝4］

表2 NT阳性细胞百分比在不同组别不同培养时间的变化［±s，n＝4］

1）经q检验分析，与空白组比较，P＜0.05

NT阳性细胞百分比组别空白组rAAV-LacZ组rAAV-AsiNOS组1 h 12.23%±1.22% 11.44%±1.29% 12.29%±1.98% 3 h 13.96%±1.09% 12.97%±1.14% 12.86%±1.00% 6 h 14.26%±2.08% 13.23%±1.25% 9.33%±1.39%1）12 h 14.16%±0.84% 15.05%±1.02% 7.34%±0.72%1）24 h 15.79%±0.95% 14.99%±0.78% 4.57%±0.58%1）

表3 iNOS阳性细胞百分比在不同组别不同培养时间的变化［±s，n＝4］

表3 iNOS阳性细胞百分比在不同组别不同培养时间的变化［±s，n＝4］

1）经q检验分析，与空白组比较，P＜0.05

iNOS阳性细胞百分比组别空白组rAAV-LacZ组rAAV-AsiNOS组1 h 23.40%±1.01% 24.13%±1.22% 23.68%±1.05% 3 h 24.32%±1.24% 23.93%±1.47% 22.27%±2.24% 6 h 24.6%±0.81% 24.32%±1.52% 18.54%±3.66%1）12 h 24.14%±1.14% 23.91%±0.76% 14.67%±0.78%1）24 h 25.17%±1.17% 24.44%±1.25% 8.30%±1.28%1）

表4 VEGF阳性细胞百分比在不同组别不同培养时间的变化［±s，n＝4］

表4 VEGF阳性细胞百分比在不同组别不同培养时间的变化［±s，n＝4］

1）经q检验分析，与空白组比较，P＜0.05

VEGF阳性细胞百分比组别空白组rAAV-LacZ组rAAV-AsiNOS组1 h 11.36%±1.02% 11.04%±1.41% 10.74%±0.91% 3 h 11.45%±1.05% 11.98%±1.25% 10.71%±1.00% 6 h 10.49%±0.68% 11.38%±1.94% 7.32%±1.74%1）12 h 11.64%±2.33% 12.37%±1.13% 6.38%±1.47%1）24 h 12.56%±0.86% 11.80%±1.24% 5.11%±1.10%1）

表5 iNOS mRNA相对值在不同组别不同培养时间的变化［±s，n＝4］

表5 iNOS mRNA相对值在不同组别不同培养时间的变化［±s，n＝4］

1）经q检验分析，与空白组比较，P＜0.05

iNOS mRNA相对值组别空白组rAAV-LacZ组rAAV-AsiNOS组1 h 0.56%±0.12% 0.53%±0.15% 0.51%±0.09% 3 h 0.59%±0.12% 0.56%±0.05% 0.52%±0.10% 6 h 0.62%±0.09% 0.59%±0.11% 0.46%±0.14%1）12 h 0.61%±0.11% 0.56%±0.11% 0.34%±0.06%1）24 h 0.61%±0.12% 0.57%±0.16% 0.21%±0.03%1）

图1 空白组不同培养时间的iNOS mRNA表达

图2 rAAV-LacZ组不同培养时间的iNOS mRNA表达

图3 rAAV-AsiNOS组不同培养时间的iNOS mRNA表达

iNOS是合成一氧化氮（NO）关键酶，参与肿瘤新生血管生成以及扩张血管等途径促进肿瘤细胞增殖，恶性肿瘤细胞产生的NO在增加肿瘤血供和促进肿瘤血管生成等方面发挥作用，iNOS和VEGF基因均参与人脑胶质瘤发生发展过程，而且与胶质瘤恶性度相关［5］。NO在体内可与超氧阴离子（superoxide O2－）快速结合生成过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite，ONOO－），NT是ONOO－在体内生成的特异性标记物［6］，在整体内NT的生成和定位可反映ONOO－的产生状态与分布，NT阳性细胞百分比能够间接反映体内NO的含量。本实验中，FCM检测结果显示，重组病毒载体rAAV-AsiNOS转染C6胶质瘤细胞6 h后，iNOS阳性细胞比、NT阳性细胞比和VEGF阳性细胞比均出现不同程度下降，说明携带iNOS反义基因的重组病毒载体能够抑制胶质瘤C6细胞iNOS表达，减少NO合成，出现NT阳性细胞比例下降，影响了VEGF表达，发挥抗肿瘤作用。然后，重组病毒载体rAAV-LacZ并不能影响iNOS在C6细胞中的表达，NT阳性细胞比和VEGF阳性细胞比与空白组相仿。

iNOS和VEGF参与体外C6胶质瘤细胞发生发展过程，其主要机制可能是各种细胞因子激活了iNOS，后者催化合成NO，调控细胞营养成分和促进细胞生长增殖。将iNOS反义RNA基因转染到C6胶质瘤细胞肿瘤，能够抑制iNOS基因的表达，减少NO合成和VEGF基因表达，抑制肿瘤血管生成，从而达到抗胶质瘤细胞生长增殖作用，也进一步证实iNOS和VEGF之间的相关性，可能共同参与调控胶质瘤生长增殖过程。

［1］Kostourou V，Cartwright JE，Johnstone AP，et al.The role of tumour-derived iNOS in tumour progression and angiogenesis［J］.Br J Cancer，2011，104（1）：83－90.

［2］ 杨卫忠，陈春美，王春华，等.诱导型一氧化氮合酶反义RNA重组腺相关病毒载体的构建［J］.福建医药杂志，2008，30（1）84－87.

［3］ 杨卫忠，陈春美，王春华，等.NOS反义RNA重组腺相关病毒载体体内提高脑细胞耐缺血能力的实验研究［J］.中国神经精神疾病杂志，2008，34（5）291－295.

［4］Giacca M.Virus-mediated gene transfer to induce therapeutic angiogenesis： where do we stand？［J］ Int J Nanomedicine，2007，2（4）：527－540.

［5］Hara A，Okayasu I.Cyclooxygenase-2 and inducible nitric oxide synthase expression in human astrocytic gliomas：correlation with angiogenesis and prognostic significance［J］.Acta Neuropathol，2004，108（1）：43－48.

［6］Torres-Dueñas D，Celes MR，Freitas A，et al.Peroxynitrite mediates the failure of neutrophil migration in severe polymicrobial sepsis in mice［J］.Br J Pharmacol，2007，152（3）：341－352.

（责任编辑：甘章平）

R743.33

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2011－01－14）

☆ 福建省教育厅科技计划项目资助（编号：JA05259）

* 福建医科大学附属协和医院神经外科 福建省神经外科研究所（福州 350001）