脑缺血再灌注早期梗死灶边缘区TLR9信号通路的活化☆

谢芬方建业潘经锐黄小雄王艺东

·论 著·

脑缺血再灌注早期梗死灶边缘区TLR9信号通路的活化☆

谢芬*方建业*潘经锐*黄小雄*王艺东*

目的 观察大鼠脑缺血再灌注早期梗死灶边缘区皮层Toll样受体9（Toll-like receptor 9，TLR9）信号通路的活化情况。方法 制备Sprague-Dawley（SD）大鼠短暂大脑中动脉闭塞模型，缺血90 min后再灌注，随机分两组：6 h组（n＝5）和3 d组（n＝5），分别采用RT-PCR、Western-blot法测定梗死灶边缘区皮层TLR9、肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、干扰素调节因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7）、干扰素－β（interferon-beta，IFN-β）的mRNA及蛋白表达。结果 6 h和3 d组TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β的mRNA表达量分别为（0.43±0.03）和（0.93±0.03）、（1.21±0.11）和（2.26±0.16）、（0.44±0.04）和（1.27±0.17）、（0.15 ±0.02）和（0.26±0.03），蛋白表达量分别为（0.75±0.04）和（1.35±0.04）、（0.93±0.04）和（1.05±0.02）、（0.54 ±0.03）和（0.73±0.02）、（0.82±0.02）和（0.93±0.03）（组间比较，均P＜0.01）。同组内TNF-α的表达明显高于IFN-β的表达（均P＜0.01）。结论 TLR9信号通路在脑梗死早期的炎症反应中可能起重要作用。

Toll样受体9 脑缺血再灌注 大鼠

炎症反应在脑缺血损伤的病理机制中起着重要的作用，早期造成组织损伤，而后期可能具有内源性修复作用［1］。炎症反应的这种“双刃剑”作用的机制是什么还不清楚。近年研究发现，先天免疫系统的重要组成部分——Toll样受体 （Toll-like receptors，TLRs）介导了缺血性损伤［2］，其中一个重要作用就是参与炎症反应。TLR9是Toll样受体家族的重要成员，定位在细胞内的内涵体膜上，在中枢神经系统中TLR9主要表达于小胶质细胞。它不仅可以被来自病原体的配体激活，而且能被组织损伤后产生的DNA片段激活。TLR9拥有两条不同的信号传导通路，分别经过转录因子NFκB（nuclear factor kappa B）或IRF7途径，诱导促炎因子TNF-α或神经保护分子IFN-β的产生。这两条通路在脑缺血后不同阶段如何发挥作用还没有研究报道。本研究拟观察大鼠脑缺血再灌注早期梗死灶边缘区皮层TLR9信号通路的活化情况，初步探讨TLR9信号通路在脑缺血损伤中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 选择清洁级健康成年雄性的SD大鼠 20只，体质量 280～330 g（由中山大学北校区实验动物中心提供，合格证号：NO.0052811），按随机数字表法分为模型组（即手术组）和假手术组，每组10只。手术组按再灌注时间点和脑组织取材来源再分为：6 h缺血侧（I 1）、6 h缺血对侧（C 1）、3 d缺血侧（I 2）、3 d缺血对侧（C 2）四个亚组。I 1和I 2在梗死灶边缘区顶叶皮层取材，C 1和C 2则在大脑对侧相应皮层取材。相同再灌注时间点的缺血侧与缺血对侧的脑组织取材于同一大鼠，6 h和3 d各5只。假手术组再分为6 h（S 1）和3 d（S 2）两个亚组，各5只，取材部位与I 1、I 2一致。

1.2 大鼠脑缺血再灌注模型的建立 参照改良Longa氏线栓法［3］制备右侧大脑中动脉闭塞模型，在阻塞大脑中动脉90 min时将栓线拔出至颈外动脉内实现再灌注。大鼠清醒后出现左上肢瘫痪、转圈、追尾征等为成功模型。假手术组不插入线栓，其余操作同手术组。术中及大鼠苏醒过程肛温保持在37℃。

1.3 反转录酶－聚合酶链式反应 （reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）上述取材的脑组织约100 mg，采用Trizol一步法提取总RNA。采用Primer5引物设计软件设计引物（引物序列见表 1）。RT扩增条件：30℃ 10 min，42℃30 min，94℃5 min；PCR扩增条件：94℃预变性1 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，重复变性、退火、延伸共35个循环，72℃，10 min。产物经琼脂糖凝胶电泳分离。利用Quantity One（ver 4.6.2）对所得的电泳图像作分析。比较目标条带与内参的光密度比值。

表1 PCR引物序列

1.4 Western-Blot 按常规方法提取脑组织总蛋白，SDS-PAGE方法电泳（条件：浓缩胶60 V，45 min，分离胶100 V，120 min），湿法转膜（转膜条件：100 V，100 min），封闭后加入一抗稀释液（TLR9：1∶670，TNF-α：1∶500，IFN-β：1∶250，IRF7：1∶200）过夜孵育约12～16 h后，再用HRP-羊抗大鼠单抗进行二抗孵育。特异性的反应条带通过化学发光系统显色。结果由BIO-RAD图像分析仪分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0对所得数据进行统计学处理。所有计量资料的比较采用t检验分析，结果用±s表示，检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 RT-PCR 脑缺血再灌注6 h和3 d大鼠梗死灶边缘区顶叶皮层均检测到TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β的mRNA表达，其相对表达量随时间延长而明显增加（均P＜0.01）。在梗死灶边缘区相应的对侧皮层，除TNF-α mRNA外，TLR9、IRF7、IFN-β的mRNA均未检测到，但TNF-α mRNA的表达未随时间的延长而增加（P＝0.451）。在同一时间点，TNF-α mRNA在梗死灶边缘区皮层的表达比对侧相应皮层的表达更高（均P＜0.01）。同一时间点比较，梗死灶边缘区皮层TNF-α mRNA的表达明显高于IFN-β mRNA的表达（均P＜0.01）。在假手术组，以上4个因子的mRNA均未见表达。结果见图1、表2。

2.2 Western-Blot 脑缺血再灌注6 h和3 d大鼠脑梗死灶边缘区顶叶皮层均检测到TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β蛋白的表达，其相对表达量随时间延长而明显增加（均P＜0.01）。在梗死灶边缘区相应的对侧皮层，除蛋白TNF-α外，蛋白TLR9、IRF7、IFN-β均未检测到，但蛋白TNF-α的表达未随时间的延长而增加；假手术组均未见上述蛋白的表达。同一时间点比较，梗死灶边缘区和对侧皮层的TNF-α蛋白表达均明显高于IFN-β蛋白表达（均P＜0.05）。结果见图2、表3。

3 讨论

TLRs是先天免疫系统的重要组成部分，在先天性和获得性免疫反应的启动中起着重要作用。TLRs的一个重要作用就是介导炎症反应，与中枢神经系统疾病密切相关的TLRs主要是TLR2、TLR4和TLR9。既往研究已证实TLR2和TLR4在脑缺血损伤中发挥作用［4］。而TLR9如何起作用还不清楚。TLR9信号通路具有TLR9-NFκB-TNF-α和TLR9-IRF7-IFN-β两条不同的信号传导通路。本实验利用脑缺血再灌注的大鼠模型，观察到脑缺血再灌注早期（6 h、3 d）TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β mRNA和蛋白表达水平在缺血侧皮层均有明显升高，而且随时间的延长增加更加明显。表明脑缺血再灌注后TLR9的两条信号通路均被激活，而且随时间延长表达增加。

本研究还发现，脑缺血再灌注6 h和3 d，TNF-α的表达量明显高于IFN-β，提示TLR9-NFκB-TNF-α通路的激活较 TLR9-IRF7-IFN-β通路的激活更强，这与脑缺血再灌注早期炎症反应造成组织损伤的研究结果一致。既往研究显示，TNF-α是急性脑缺血损伤后重要的炎症因子。TNF-α能刺激组织因子和白细胞粘附分子的表达，促进白细胞介素－1、一氧化氮、血管性血友病第八因子、血小板激活因子和内皮素的释放，抑制凝血酶调节素－蛋白C－蛋白S系统的活性，减少组织纤溶酶原激活物的产生，从而减少纤溶酶原激活物抑制剂－1的释放。TNF-α还能通过诱导黄嘌呤氧化酶，环氧合酶和烟酰胺腺嘌呤磷酸氢二核苷酸氧化酶以及其他相关的酶活性刺激内皮细胞产生活性氧化物。以上这些效应刺激局部脑血管，使局部脑血管易于形成炎症、血栓和发生出血，从而促进缺血性脑卒中的发生和进展［5－6］。近年研究发现，IFN-β不仅具有抗病毒效应，在抗炎症方面也发挥积极的作用。在细胞水平，IFN-β被证明能减少活性氧化物［7］，抑制炎症细胞因子产物和诱导由星形胶质细胞产生的促神经生长因子产物——白细胞介素－1受体拮抗剂［8］。本实验观察到，随着时间的延长，IFN-β在缺血组织中的表达呈现增高的趋势，因此推测，IFN-β可能在脑缺血再灌注后期发挥作用，值得进一步研究。

图1 大鼠顶叶皮层TLR9，TNF-α，IRF7和IFN-β的mRNA表达。其中I 1、I 2、C 1、C 2、S 1、S 2分别代表：6 h缺血侧，3 d缺血侧，6 h缺血对侧，3 d缺血对侧，假手术6 h，假手术3 d

图2 大鼠顶叶皮层TLR9，TNF-α，IRF7和IFN-β的蛋白表达

表2 大鼠顶叶皮层TLR9信号分子mRNA表达

表3 大鼠顶叶皮层TLR9信号分子蛋白表达

本实验在缺血对侧的皮层中，TNF-α mRNA和蛋白均有表达，但没有随时间的变化而变化，表达量也明显少于缺血侧。Sairanen等［9］的研究也发现，梗死灶中心和边缘区TNF-α的表达升高，而在对侧脑组织和其他远隔部位也能观察到TNF-α的表达，但表达的量要低于梗死侧。本实验在缺血对侧的皮层中，未观察到TLR9、IRF7、IFN-β mRNA和蛋白的表达，说明缺血对侧的TNF-α表达可能与TLR9的激活无关，是什么原因所致，还需要进一步研究来证实。

综上所述，本研究观察到，在脑缺血再灌注早期，TLR9的两条信号通路均被激活，分别产生了促炎因子TNF-α和神经保护分子IFN-β，而TNF-α的表达明显强于IFN-β。提示TLR9信号通路在脑梗死早期的炎症反应中可能起重要作用。

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The activation of TLR9 signaling pathway in the peri-infarct cortex at the early stage of cerebral ischemiareperfusion.

XIE Fen，FANG Jianye，PAN Jingrui，HUANG Xiaoxiong，WANG Yidong.Department of Neurology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.Tel：020－81332619.

Objective To study the activation of toll-like receptor 9（TLR9）signaling pathway in the peri-infarct cortex at the early stage of ischemia-reperfusion in a rat model of middle cerebral artery occlusion（MCAO）.Methods The MCAO model was induced in male rats by using intraluminal filament technique and reperfusion was performed by removing the filament at 90 minutes after occlusion.The MCAO rats were randomly assigned to 2 groups：6 h group（n＝5）and 3d group（n＝5）.RT-PCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expression of TLR9， TNF-α， IRF7 and IFN-β in the peri-infarct cortex.Results The mRNA and protein expression of TLR9，TNF-α，IRF7 and IFN-β were significantly higher in the 3 d group than in the 6 h group（mRNA：0.93±0.03 vs.0.43 ±0.03 on TLR9，2.26±0.16 vs.1.21±0.11 on TNF-α，1.27±0.17 vs.0.44±0.04 on IRF7，0.26±0.03 vs.0.15± 0.02 on IFN-β；protein：1.35±0.04 vs.0.75±0.04 on TLR9，1.05±0.02 vs.0.93±0.04 on TNF-α，0.73±0.02 vs.0.54±0.03 on IRF7，0.93±0.03 vs.0.82±0.02 on IFN-β；P＜0.01）.The mRNA and protein expression of TNF-α were significantly higher than IFN-β in the peri-infarct cortex at all time points（P＜0.01）.Conclusions TLR9 signaling pathway may play a critical role in the inflammatory response at the early stage of cerebral infarction.

Toll-like receptor 9 Cerebral ischemia-reperfusion Rat

R741

A

2011－05－06）

（责任编辑：李 立）

☆ 国家自然科学基金（编号：81171103），广东省自然科学基金（编号：9151008901000028，S2011010006043）

* 中山大学孙逸仙纪念医院神经科（广州 510120）

（E-mail：wydys＠yahoo.com.cn）