3个单纯型发作性运动诱发性运动障碍家系的致病基因定位

陈素琴王一鸣李洵桦梁秀龄周珏倩方莹莹

·论 著·

3个单纯型发作性运动诱发性运动障碍家系的致病基因定位

陈素琴*王一鸣*李洵桦△梁秀龄△周珏倩△方莹莹△

目的 在3个中国汉族单纯型发作性运动诱发性运动障碍 （paroxysmal kinesigenic dyskinesia，PKD）家系中确定其疾病基因所在区域。 方法 在已知的PKD连锁区域 16p12.2-q22.3选取 14个微卫星遗传标记对37位家庭成员进行基因分型，用Linkage和Genehunter等软件进行连锁分析并构建疾病单倍型。结果 连锁分析及单倍型分析将致病基因定位于D16S3133～D16S3044（16p12.1-q12.1）之间11.2 cM的区域。结论 3个汉族单纯型PKD家系的致病基因被定位于D16S3133～D16S3044（16p12.1-q12.1）之间，与最初的婴儿惊厥及阵发性舞蹈手足徐动症（infantile convulsions and paroxysmal choreoathetosis，ICCA）的位点重叠。

发作性运动诱发性运动障碍 基因定位 连锁分析

发作性运动诱发性运动障碍 （paroxysmal kinesigenic dyskinesia，PKD，OMIN 128200）是发作性运动障碍（paroxysmal dyskinesia）中最常见的一种，主要表现为突然运动诱发的肌张力障碍、舞蹈、手足徐动等不自主运动，发作持续时间一般不超过1 min，发作期间意识清醒，对抗惊厥药物有良好的反应［1］。PKD可以是散发性或家族性，后者多呈常染色体显性遗传，伴外显不完全。PKD具有临床表型异质性。有些PKD患者伴有婴儿惊厥、癫痫、偏头痛或其他神经系统疾病。不伴有其他神经系统疾病者，称之为“单纯型PKD”。

PKD存在着遗传异质性，已报道的致病基因位点有 3个：位于 16p11.2-q12.1区域的 EKD1位点［2］，位于 16q13-q22.1区域的 EKD2位点［3］，以及可能位于 3q28-29的 EKD3位点［4］。其中，EKD1是最常见的 PKD致病基因位点，已有多个不同种族的PKD或婴儿惊厥及发作性舞蹈手足徐动症 （infantile convulsions and paroxysmal choreoathetosis，ICCA，OMIM 602066）和良性家族性婴儿惊厥 （benign familial infantile convulsions，BFIC，OMIN 605751）家系定位于此［5－13］。目前3个位点的疾病基因均未被克隆。

我们收集到了3个常染色体显性遗传的单纯型PKD家系，在覆盖已知的EKD1和EKD2位点范围选取14个微卫星遗传标记（marker）进行基因分型，利用Linkage和Genehunter等软件进行参数和非参数连锁分析，并构建致病单倍型。

1 材料与方法

1.1 研究对象 3个中国汉族PKD家系，家系1（图2A）和2（图2B）来自广东，家系3（图2C）来自湖南。每个家系各有6例PKD患者，家系2中的Ⅱ：9和家系3中的Ⅲ：7为婴幼儿起病的癫痫患者，但无PKD症状。所有PKD患者无合并癫痫及其他神经系统疾病，为单纯型PKD。3个家系总的男女患者病例为1∶1，遗传方式为常染色体显性遗传。

患者发病年龄8～18岁，平均为10.8岁；表现为发作性一侧或双侧的肢体、躯干、面部异常运动，出现四肢舞蹈、手足徐动、颤搐、躯体扭转等。发作程度不一，严重发作时四肢及面部异常活动致倒地，轻者仅感觉突然运动时一侧肢体瞬间的不自主运动。女性症状多较男性为轻。发作时意识清醒。诱发因素多为突然运动、用力、惊吓等，以静坐或久站后突然运动诱发最为常见。发作持续时间，一般不超过1 min。发作频率不定，可有一段时间不发作或一天发作数10次。发作间期正常。神经系统检查均未发现阳性体征。先证者头颅CT或MRI检查及脑电图检查未发现异常。所有患者均符合Bruno等［1］制定的PKD诊断标准。

我们对3个家系中的15例PKD患者及22名无PKD症状的家系成员，在获得参与者的知情同意后，采集外周血，进行遗传学分析。

1.2 基因组DNA的提取 取外周静脉血10 mL，EDTA抗凝，用QlAamp DNA Blood Maxi Kit（Qiagen，德国）抽提DNA，严格按照说明书操作。－70℃保存DNA。

1.3 基因型分析 选择14个覆盖PKD已知位点 16p11.2-q22.1的微卫星标记 （marker），包括D16S403，D16S3133，D16S3068，D16S3131，D16S3093，D16S3044，D16S3080，D16S3136，D16S419，D16S3034，D16S3140，D16S3057，D16S514和D16S3066。平均相邻的Marker间距为3.0 cM，部分Marker来自ABI Linkage Mapping Set v2.5 HD5；部分由上海生工合成，合成的引物序列来自UCSC Genome Browser（http：／／genome.ucsc.edu／cgi-bin／hgGateway）。其中ABI Linkage Mapping Set v2.5 HD5的引物，其上游标有FAM、VIC或NED不用颜色的荧光染料；而合成的引物，其上游标有FAM荧光染料。PCR反应在96孔微量板中进行，10 μL反应体系，采用Touchdown法，在ABI 9700PCR仪上完成。反应条件为：95℃5 min；95℃30 s，64℃30 s，每个循环降低1℃，72℃45 s，10个循环；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，25个循环。 PCR产物与去离子甲酰胺及GeneScanTM-500-LIZ按标准体系混匀后，95℃热变性5 min，迅速置于冰块上冷却3 min，由ABI 3100基因分析仪进行毛细管电泳分离及数据收集。应用GenesScan Analysis v3.7软件进行分子量内标GS-500校正，并自动将凝胶图像转换为数字信号文件。采用Genotyper Software v2.1软件将各泳道内的PCR产物进行等位基因分型。

1.4 连锁分析 根据家系成员每个位点的等位基因型，用Linkage软件（Version 5.1）中的MLINK软件进行两点连锁关系分析［14］。参数设置如下：遗传方式为常染色体显性遗传，外显率分别设为0.9、0.8或0.7，疾病基因频率为10－4，男女重组率相同。遗传标记的等位基因频率设为1／n，其中n为3个家系中所观察到的等位基因数目。利用FASTMAP软件对两点连锁分析的数据进行多点连锁分析［15］，利用Genehunter软件（Version 2.1）进行多点参数与非参数连锁分析［16］，其中遗传标记间的遗传距离来自Marshfield，sex averaged，linkage map （http：／／research.marshfieldclinic.org／genet ics／GeneticResearch／compMaps.asp）。用HOMOG软件进行遗传异质性分析［17］。

1.5 单倍型的构建 利用 Cyrillic 2.1软件构建单倍型，并按照家系中交换数最少的原则对单倍型进行人工校正。分析单倍型与疾病状态共分离的情况，确定所有患者共同携带的单倍型。

表1 不同外显率下3个PKD家系总的两点LOD值

2 结果

2.1 连锁分析 在两点连锁分析中，3个家系总LOD值，在D16S3080处取得最大值，在外显率为0.9，0.8，0.7，重组率θ＝0时分别为3.16，3.08和2.97。 总 LOD 值 大于 2.0的 另 一 Marker为D16S3068，在外显率为0.9，0.8，0.7，重组率θ＝0时分别为2.83，2.69和2.53（表1）。根据LOD值的评判标准，支持D163080和D16S3068与致病基因存在连锁；而且当外显率为0.9，0.8时，显著支持D163080与致病基因存在连锁。位于EDK2位点的Marker DS3140，D16S3057，D16S514和D16S3066在外显率为0.9，0.8，0.7时LOD值均远远小于－2，提示这些位点与致病基因不连锁。

FASTMAP软件的多点参数连锁分析结果显示，外显率为0.9，0.8及0.7时，其最大LOD值均位于D16S3068～D16S3131之间 （未提供数据）。GENEHUNTER软件的多点参数连锁分析结果显示，外显率为0.9或0.8时，Marshfield图谱中的59.68 cM处 （D16S3080位点）取得最大LOD值2.54或2.56（未提供数据）；外显率为0.7时，最大LOD值2.75位于Marshfield图谱中的D16S3068～D16S3131之间（图1）。多点非参数连锁分析结果显示，NPL值在D16S3068～D16S3093之间取得最大NPL值3.85（p＝0.002）（图1），根据Lander等提出的显著性连锁阈值为3.6的标准［18］，显著支持致病基因与该区域连锁。用HOMOG软件进行遗传异质性检验，未拒绝遗传同质性（未提供数据）。

2.2 单倍型分析 在上述14个Marker中，选取能够提供重组交换信息的11个，构建单倍型并进行分析（图2）。

图1 当外显率为0.7时，11个微卫星遗传标记在3个PKD家系中的总的多点连锁分析图谱。 实的曲线表示参数连锁分析的LOD值，虚的曲线表示非参数连锁分析的NPL值，X轴上的数值表示Marshfield图谱中的遗传距离

图2 PKD家系1～3的系谱及单倍型图。11个微卫星遗传标记在单倍型图的左侧。 括号里的数字表示由双亲、同胞及子女推导得到的基因型。黑色柱状图表示疾病单倍型；白色柱状图表示正常单倍型；斜纹柱状图表示可能为疾病或正常单倍型。 右上角上的＋表示癫痫患者

家系-1的单倍型分析提示（图2A），所有患者都携带有D16S3068～D16S3034间的3-2-3-1-3-1-2－3单倍型。Ⅲ：2，Ⅲ：3携带有该单倍型，Ⅱ：1携带有部分该单倍型，但无患病。

家系-2的单倍型分析提示（图2B），Ⅲ：1发生了两次重组。其中的一次重组发生在D16S3093和D16S3044之间。由于II-2的D16S419和D16S3034为等位基因的纯合子，因而另一次重组有2种可能：可能发生D16S3136和D16S419间，也可能发生D16S3034和D16S3140之间。所有患者都携带有D16S3133～D16S3093间的3-1-2-2单倍型和／或D16S419～D16S3034间3-3单倍型。由于该家系的非参数连锁分析的最大 NPL值 3.23位于D16S3133～D16S3093之间（未提供数据），并且3个家系总的最大NPL值3.85也位于该区域，故致病单倍型位于D16S3133～D16S3044之间。Ⅲ：3携带有 D16S3133～D16S3093间的 3-1-2-2单倍型，但无患病。

图3 PKD、ICCA及BFIC在16号染色体区域的定位图谱。各条直线对应于不同的家系及定位区域。1：4个ICCA的法国家系［11］；2：1个ICCA的中国家系［12］；3：7个来自阿根廷和法国的BFIC家系［13］；4：8个日本PKD／IC家系［2］；5：1个非洲裔美国人PKD家系［5］；6：11个多种族的 PKD／IC家系［6］；7：1个西班牙 PKD家系［7］；8：7个日本PKD家系［8］；9：4个中国PKD家系［10］；10：1个印度家系的EKD2位点［4］；11为本研究中的3个PKD中国家系

家系3的单倍型分析提示 （图2C），3例患者都携带有D16S403与D16S3140间的3-3-2-3-2-2-4-1-2-4-3单倍型。Ⅲ：7为癫痫患者，也携带有该单倍型，但无PKD症状。

在本研究中，3个家系中携带有致病单倍型的个体共有21例，有PKD表型的只有15例，外显率为71.4%。故在连锁分析时，外显率设置为0.7比较合理。结合单倍型分析和连锁分析结果，致病基因所在单倍型区域为 D16S3133～D16S3044间。

3 讨论

PKD具有临床表型和遗传异质性。有些PKD患者伴有婴儿惊厥、癫痫、偏头痛或其他神经系统疾病。由于基因定位于相同的区域，ICCA和BFIC被认为与PKD是同一疾病的不同临床表现。

家族性PKD多呈常染色体显性遗传，伴外显不完全。目前为止，已报道的PKD致病基因位点有3个：位于16p11.2-q12.1区域的EKD1位点［2］，位于16q13-q22.1区域的EKD2位点［3］，以及可能位于3q28-29的EKD3位点［4］。其中，EKD1是最常见PKD致病基因位点，已有多个不同种族的PKD或ICCA或BFIC定位于此［2，5－13］（图3）。

本研究中的3个家系符合常染色体显性遗传，且为不伴婴儿惊厥、癫痫和偏头痛等其他神经系统疾病，属于单纯型PKD。在两点连锁分析中，3个家系总的LOD值，在D16S3080处取得最大值2.97（在外显率为0.7，重组率θ＝0时）；在外显率为0.7，重组率θ＝0时D16S3068处的LOD值为2.53 （表1）。多点参数和非参数连锁分析结果提示，最大的LOD值2.75和最大的NPL值3.85都位于D16S3068位点附近。单倍型分析时，家系2中的Ⅲ：1在研究区域内发生了两次重组交换，使最大致病基因所在区域大大缩窄，其中一次的重组位点有两种可能：位于D16S3133～D16S3044之间，或位于D16S3136与D16S3140之间。而两点连锁分析、多点参数和非参数连锁分析的结果均支持致病基因所在单倍型区域位于 D16S3133～D16S3044之间。

D16S3133～D16S3044区域 位于 16p12.1-q12.1，属于EDK1位点。其Marshfield图谱的遗传图距为11.52 cM，UCSC物理距离为22.7 Mb。该区域与已报道的PKD位点都有部分的重叠，但在16q端比目前已报道的位点［2，5－10，12－13］更靠近着丝粒（图3）。该区域与1997年Szepetowski P等［11］报道的4个来自法国西北部的ICCA家系的致病基因所在区域D16S401～D16S517重叠。该4个家系的特点是：患者在3～12个月时出现无热性婴儿惊厥（infantile convulsion，IC），预后良好，使用抗惊厥药后无复发；其后多数在5～19岁出现发作性舞蹈手足徐动症，家系中大部分患者同时具有婴儿惊厥和发作性舞蹈手足徐动症症状。本研究的结果支持了ICCA与PKD可能是同一致病基因的不同临床表现的观点。

由于PKD外显不完全，在参数连锁分析中，不同的外显率会影响分析结果。本研究中携带有致病单倍型的个体共有21例，有PKD表型的只有15例，外显率为71.4%。外显率取0.7时，本研究的多点非参数连锁分析的最大NPL值与多点参数连锁分析的最大LOD值及所在区域基本吻合。故外显率设置为0.7时，连锁分析的结果更有参考意义。

PKD的发病被认为有性别差异。在8个日本PKD家系中，男女患病率为2∶1，男女外显率的比例分别为0.94和0.74［2］。本研究中男女患者数目相同，但女性症状多较男性为轻，轻者仅感觉突然运动时一侧肢体瞬间的不自主运动。这表明，可能存在一个性别依赖的修饰因子影响PKD突变基因的敏感性［2］。

PKD的病因及发病机制至今不清楚。有些学者认为PKD是一种反射性癫痫［19］。PKD家系中癫痫患病率明显高于一般人群，有报道PKD合并癫痫的发生率为8%［20］。本研究的3个家系中有2例婴幼儿起病的癫痫患者，都不合并PKD，但其中一人（家系3的Ⅲ：7）携带有PKD的致病单倍型。该结果提示，PKD可能与癫痫有共同的发病基础。也有学者认为PKD源于基底节功能障碍［21］。虽然这些争论还在继续，但许多证据表明，PKD可能是一种离子通道病［22］。而16号染色体性着丝粒区域有一基因簇编码溶质载体，包括 Na＋／Cl－、K＋／Cl－通道，Na＋／H＋和神经递质通道，而且这些基因大多数位于ICCA及PKD区域。因此位于16号染色体着丝粒周围区域编码或控制离子通道功能的基因被认为是PKD、ICCA和BFIC等候选基因［23］。目前已在一些 PKD家系中排除了部分候选基因［8，9，24］，甚至在一例ICCA患者中发现位于 16p11.2的 0.6 Mb的微缺失［25］。PKD致病基因区域的进一步缩窄、致病基因区域（尤其是16p11.2微缺失区域）其他基因的克隆及对其他候选基因的突变筛查，有望找到PKD的致病性突变。PKD致病基因及基因功能的阐明将解开PKD临床症状复杂多样及遗传异质性之谜。

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Mapping of the gene responsible for pure paroxysmal kinesigenic dyskinesia in three Chinese Han families.

CHEN Suqin，WANG Yiming，LI Xunhua，LIANG Xiuling，ZHOU Jueqian，FANG Yingying.Department of Neurology，the First Affiliated Hospital，Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510089，China.Tel：020－87755766.

Objective To map the gene responsible for pure paroxysmal kinesigenic dyskinesia in three Chinese Han families.Methods Fourteen microsatellite markers flanking 16p12.2-q22.3 were selected for genotyping in 37 family members.Parameter and non-parameter analysis were performed using Linkage and Genehunter softwares and haplotypes were constructed.Results A maximum two-lod score 2.97 at D16S3080 （θ＝0） and 2.53 at D16S3068（θ＝0）were obtained when penetrance set to 0.7.A maximum multi-lod score 2.75 and maximum NPL score 3.85（P＝0.002） were obtained at D16S3068～D16S3131.Haplotype analysis localized PKD to the region D16S3133～D16S3044（16p12.1-q12.1）.Conclusions The gene responsible for PKD in three Chinese Han families was mapped to 16p12.1-q12.1， which was the same as the original ICCA （infantile convulsions and paroxysmal choreoathetosis）region.

Paroxysmal kinesigenic dyskinesia Gene mapping Linkage analysis

R744

A

2010－10－09）

（责任编辑：李 立）

☆ 国家自然科学基金项目（编号：30671154）

* 中山大学中山医学院遗传学教研室

（E-mail：lxunh＠yahoo.com.cn）

△ 中山大学附属第一医院神经内科