Wnt抑制因子SFRP基因甲基化与白血病的关系

裴 磊，叶丽平

(1中国医科大学，沈阳110001;2辽宁医学院病理生理学教研室)

近年来研究发现，Wnt信号通路在胚胎发育、细胞行为、基因表达、肿瘤增生以及细胞凋亡等生命过程中发挥重要作用;其异常激活会促进细胞过度生长、增殖和分化，与白血病及其相关疾病的发生和发展有着密切关系。Wnt通路抑制因子分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)在结构上与卷曲蛋白(Fz)受体极为相似，与Fz受体竞争结合Wnt从而抑制Wnt通路的活动。但当SFRP异常甲基化导致表达沉默时，对Wnt通路的抑制作用减弱，从而促进了白血病的发生与发展。本文就SFRP分子对白血病发生与发展的影响进行综述。

1 Wnt基因家族及其信号转导通路与白血病

至今已有大量实验证实，Wnt通路的异常活化与许多肿瘤发生有着密切关系。Wnt信号转导通路因其启动Wnt蛋白而得名，包括3条细胞内信号通路:① Wnt经典信号转导途径，即Wnt-β-catenin信号转导途径;②Wnt-平面细胞极性(PCP)途径;③Wnt-Ca2+途径［1］。其中 Wnt-β-catenin 信号转导途径是Wnt中最重要也是研究最清楚的信号通路。

Wnt蛋白是一类富含半胱氨酸残基的分泌型糖蛋白，由Wnt基因编码，通过自分泌或旁分泌发挥作用。Wnt蛋白有350～380个氨基酸组成，其中超过100个氨基酸是保守的，包括23～24个半胱氨酸残基。Wnt蛋白分泌后与细胞表面基质及其特异性受体Fz受体相互作用。Fz受体包括一个细胞外N端半胱氨酸富集区(CRD)，7次跨膜区和胞质区(CD)。Wnt与Fz受体结合后，信号经由蓬乱蛋白(Dsh)转导，使由 APC、axin、糖原合成酶激酶(GSK3β)、CK1α 组成的“降解复合物”聚解［2］，抑制 GSK3β 活性，防止 β-catenin磷酸化，使β-catenin降解受抑，从而使胞内游离β-catenin增多。β-catenin可以转位核内，与淋巴细胞增强因子/T细胞因子(LEF/TCF)族中的转录活化因子结合，形成复合体，解除LEF/TCF的抑制状态，增强下游靶基因的转录活性，从而促进细胞增殖，抑制凋亡［3］。PCP途径［4］在脊椎动物中又称Wnt/JUN激酶途径，涉及到小三磷酸鸟苷酸酶Rac和RhoA，以及它们下游的 Rho激酶和 JUN激酶，主要作用可能是调节细胞的迁移，在胚胎发育过程中调控细胞的汇聚延长运动，参与原肠胚的形成［5］。Wnt/Ca2+途径中，Wnt蛋白与Fz受体结合，通过三聚体G蛋白介导，使胞内Ca2+浓度升高，激活钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、蛋白激酶C(PKC)，调节细胞生命活动［6］。

在Wnt-/β-catenin途径中，Wnt信号通过一系列酶促瀑布反应，抑制β-catenin的降解，调控很多基因的转录与表达。一旦Wnt信号通路任一环节出现异常，都会使β-catenin降解受抑，导致在胞内积累过多进入核内，与核内的转录因子结合，刺激靶基因 c-myc、cyclinD1、MMP-7、ITF-2、fra-1、BMP-4、survivin 等的转录与表达［7，8］，导致细胞异常增殖、分化，最终导致白血病等肿瘤的发生。β-catenin核内水平增高是经典Wnt信号通路诱发肿瘤的关键环节。

2 SFRP家族成员及其与Wnt信号转导通路

SFRP家族是Wnt抑制因子中最大的家族，其中最早发现的是Frzb，它和Fz有相似的序列，并被发现在爪蟾蜍体内能够结合Wnt8，参与调节Wnt-β-catenin信号转导途径，成为SFRP作为Wnt拮抗因子的有力证据。SFRP也是一种分泌性糖蛋白，分子量30～40 kD，包括一个N端与Fz的CRD同源的半胱氨酸富含区(cysteine-rich domain)和一个C端Netrin-Related motif(NTR)。SFRP在结构上与Fz极为相似，与Fz的胞外CRD区域有30% ～50%的同源性，但是缺少7次跨膜结构域，可以与Fz竞争结合Wnt从而抑制Wnt通路的活动。研究者们虽然在开始时的研究中发现CRD对于SFRP与Wnt结合起到至关重要的作用，但是随后的研究表明CRD可以与 Fz和Tolloid-like金属蛋白酶相互作用，而NTR与CRD同时存在时也可以紧紧地与Wnt配体结合［9］。因此可见，SFRP基因的正常表达对于抑制Wnt信号通路异常激活有着显著作用，从而控制核内β-catenin水平，防止肿瘤诱发。而Bovolenta等［1］则认为，SFRP除了能与Wnt或Fz受体结合形成复合体，从而阻断Wnt信号的转导外，还可以自身相互作用，形成二聚体，促进信号传导;某些SFRP还可以通过转运Wnt至Fz受体或直接与Fz结合，促进信号转导。

3 SFRPs甲基化与白血病

近几年对 SFRPs的研究发现，SFRP1、2、4、5启动子中均含有CpG岛结构［10］，且CpG岛的频繁甲基化的表达下调作用可以激活Wnt信号通路从而促成肿瘤细胞抵抗凋亡［11］。一旦SFRP基因高甲基化致转录沉默，SFRP合成减少，导致Wnt信号通路异常活化，从而使具有调控转录活性的核心效应蛋白β-catenin在细胞内增多并移位核内，刺激靶基因转录和表达，最终诱发相关肿瘤。如果发生在白细胞中，则白细胞可能会恶性、无限制地增生，浸润全身各组织和脏器，最终或许会诱发白血病的发生。

已有研究表明，Wnt异常信号激活肿瘤的重要机制是一种或多种可溶性Wnt抑制基因的甲基化，进而转录沉默所致，且去甲基化后恢复其表达可抑制肿瘤的恶性行为，并由此支持SFRP基因将成为相关肿瘤的候选抑癌基因［12］。由于一定程度的SFRP表达可以抑制Wnt信号通路的传导，当SFRP表达缺失或基因沉默时都将可能使白细胞过度增殖，促进白血病的进展。近年来已有大量研究表明，SFRP基因甲基化普遍存在于各种恶性血液病中。SFRP的CpG岛甲基化所导致的基因表达沉默可引发慢性淋巴细胞白血病Wnt信号通路异常活化［13］。急性白血病中SFRP的高度甲基化也是很常见的现象［14，15］。

3.1 SFRP1 Pehlivan 等［16］为了研究在慢性髓性白血病(CML)中SFRP的表观遗传沉默是否与Wnt活化有关，检测了48例处在慢性期CML患者的SFRP1启动子的甲基化和突变水平。结果显示有6例患者呈现半甲基化，只有1例患者完全甲基化。尽管在慢性期CML中SFRP1的启动子甲基化很少发生，但是FRP1基因启动子甲基化可能表明了疾病抵抗治疗的一种不稳定的形式，以及一种可能的CML患者中激活经典Wnt信号通路的机制。Liu等［13］通过细致研究发现，在所有的慢性淋巴细胞白血病患者样本中，SFRP家族成员之一的SFRP1都呈现高度甲基化状态和下调。这表明这种表观遗传学的事件是白血病的发生以及发展中具有关键性的一步。

3.2 SFRP2 Jost等［17］通过分析急性髓性白血病(AML)中SFRP的表观遗传调节紊乱，利用WSP检测白血病细胞系中SFRP1、2、4、5基因启动子甲基化水平，发现这四种SFRP基因都出现CpG岛上的异常甲基化。实时反转录-PCR方法检测，证明了SFRP1、2转录沉默，并且对细胞系中5-aza-2＇-deoxycytidine的治疗会导致再表达，异常甲基化频率是SFRP1 29%、SFRP2 19%、SFRP4 0%、SFRP5 9%。早期AML患者SFRP2出现基因的转录下调并且与启动子高甲基化之间存在联系。Griffiths等［15］发现，SFRP2基因甲基化与AML病死率密切相关。

3.3 SFRP4 Liu 等［3］发现 SFRP4 作为 Wnt信号通路的负性调节因子，其在CML中基因的甲基化频率较高。但是在AML中SFRP4基因启动子甲基化比例不高(10.2%)。Xu等［14］在检测四种白血病细胞系SFRP甲基化程度时发现，SFRP4在NB4、Molt-4和Jurket中发生甲基化，但是在HL60中甲基化与非甲基化同时被检测到，呈部分甲基化状态。

3.4 SFRP5 Jost等［17］在研究恶性浆细胞紊乱 Wnt途径表观遗传调节失常的临床影响时，发现SFRP5的甲基化只局限于成熟期的多发性骨髓瘤以及浆细胞白血病，提示SFRP5基因高度甲基化可能对多发性骨髓瘤的发生与发展起到一定作用。Griffiths等［15］研究发现，SFRP2和SFRP5基因的甲基化程度与AML复发的风险相关联。

徐成波等［11］通过研究发现，在9种恶性血液病细胞系中SFRP1、2基因启动子区均呈高甲基化状态，CA46、HL60和U937细胞中的SFRP4基因以及U266细胞中的SFRP5基因启动子区呈部分甲基化状态，其他细胞系SFRP4、5基因启动子均呈完全甲基化状态。正常人外周血单个核细胞中SFRP1、2、4、5基因启动子区均呈非甲基化状态。在59例AML患者中，SFRP1、3、4、5基因异常甲基化频率分别是33.9%、23.7%、6.8%、10.2%;在 28 例急性淋巴细胞白血病患者中，SFRP1、2、4、5 基因异常甲基化频率分别为39.3%、28.6%、25.0%、32.1%。这说明 SFRP 基因启动子区的异常甲基化与恶性血液病的发生密切相关，并且SFRP家族中成员(SFRP1、2、4、5)在各种类型的白血病中甲基化的程度不一，不同的SFRP分子在各种类型白血病的发生、发展、转化的过程中的表达以及对各种白血病的影响不尽相同。

4 结语与展望

SFRP家族是Wnt途径的调节因子。SFRP通过抑制Wnt信号通路，在细胞凋亡、胚胎发育、抗肿瘤等方面发挥关键作用，并能抑制细胞增殖与分化。其表达缺失、基因沉默或过度表达都可能促进肿瘤发生，因此与多种恶性肿瘤的产生密切相关。SFRP基因可能是一个与白血病相关的抑制基因，抑制Wnt信号通路转导，在白血病的发生和发展过程中起到重要作用，可能成为白血病诊断的一种生物学标记［18］，并且为白血病靶向治疗的开展提供新的思路及广阔的应用前景。SFRP对Wnt的调控活动机制非常复杂，尚需进一步的研究。

［1］Bovolenta P，Esteve P，Ruiz MZ，et al.Beyond Wnt inhibition:new functions of secreted Frizzled-related proteins in development and disease［J］.JCell Sci，2008，121(Pt6):737-746.

［2］Liu X，Rubin JS，Kimmel AR.Rapid，Wnt2 induced changes in GSK3beta associations that regulate beta-catenin stabilization are mediated by Galpha proteins［J］.Curr Biol，2005，15(2):1989-1997.

［3］Liu F，van den Broek O，Destrée O，et al.Distinct roles for Xenopus Tcf/Lef genes inmediating specific responses toWnt/beta-catenin signalling in mesoderm development［J］.Development，2005，132(24):5375-5385.

［4］Kikuchi A，Yamamoto H，Kishida S.Multiplicity of the interactions ofWnt proteins and their receptors［J］.Cell Signal，2007，19(4):659-671.

［5］Veeman MT，Axelrod JD，Moon RT.A second canon functions and mechanisms ofβ-catenin-independentWnt signaling［J］.Dev Cell，2003，5(3):368-377.

［6］van de Schans VA，Smits JF，Blankesteijn WM.The Wnt/frizzled pathway in cardiovascular development and disease:friend or foe［J］.Eur JPharmacol，2008，585(2-3):338-345.

［7］Wang HL，Wang J，Xiao SY，et al.Elevated protein expression of cyclin D1 and Fra-1 but decreased expression of c-Myc in human colorectal adenocarcinomas overexpressing beta-catenin［J］.Int J Cancer，2002，101(4):301-310.

［8］Cadigan KM，Liu YI.Wnt signaling:complexity at the surface［J］.JCell Sci，2006，119(Pt3):395-402.

［9］Esteve P，Bovolenta P.The advantages and disadvantages of sfrp1 and sfrp2 expression in pathological events［J］.Yohoku JExp Med，2010，221(1):11-17.

［10］Esteller M，Com PC，Baylin SB，et al.A gene hypermethylation profile of human cancer［J］.Cancer Res，2001，61(8):3225-3229.

［11］徐成波，沈建箴.恶性血液病细胞系分泌型卷曲相关蛋白基因启动子CpG岛甲基化状态的检测及意义［J］.中国实验血液学杂志，2009，17(6):1487-1491.

［12］罗丽敏，王俐.Wnt通路抑制因子Sfrp的研究进展［J］.医学综述，2007，13(10)，729-731.

［13］Liu TH，Raval A.CpG islandmethylation and expression of the secreted frizzled-related protein gene family in chronic lymphocytic leukemia［J］.Cancer Res，2006，66(2):653-658.

［14］Xu CB，Shen JZ，Shen SF，et al.The significance ofmethylation status of secreted frizzled-related protein gene promoter in acute leukemia［J］.Zhonghua Neine Zazhi，2010，49(9):769-771.

［15］Griffiths EA，Gore SD.Acutemyeloid leukemia is characterized by Wnt pathway inhibitor promoter hypermethylation［J］.Leuk Lymphoma，2010，51(9):1711-1719.

［16］Pehlivan M，Sercan Z.sFRP1 promoter methylation is associated with persistent Philadelphia chromosome in chronicmyeloid leukemia［J］.Leuk Res，2009，33(8):1062-1067.

［17］Jost E，Schmid J.Epigenetic inactivation of secreted Frizzled-related proteins in acutemyeloid leukaemia［J］.Br JHaematol，2008，142(5):745-753.

［18］Ahn JB，ChungWB.DNAmethylation predicts recurrence from resected stage IIIproximal colon cancer［J］.Cancer，2011，117(9):1847-1854.