实时定量RT-PCR检测PML-RARα融合基因诊断APL的临床价值

陆 伟，秦 燕，丁润生，尹 红

(南通大学附属医院，江苏 南通 226001)

急性早幼粒细胞白血病(APL)是急性髓系白血病(AML)的一个特殊类型，95%以上APL存在 t(15;17)(q22;q21)染色体易位，产生PML-RARα融合基因，是APL诊断和微小残留病(MRD)的重要分子标志［1］。根据 PML基因的断裂位点不同，PML-RARα融合基因可分为3种，分别为L型、V型S型，在PML-RARα融合基因中所占比例分别为50%、5%、45%［2］。我们应用一步法实时荧光定量逆转录PCR(RQ-RT-PCR)针对上述最特异、最常见的恶性克隆基因片段，检测APL患者初诊及缓解后融合基因转录本mRNA的表达，探讨其在APL患者诊断及MRD检测中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2008年6月～2011年4月在南通大学附属医院血液内科就诊的初发APL患者42例，男27例、女15例，年龄18～64岁、中位年龄36岁;均根据形态学、组织化学、流式细胞术和遗传学检查确诊。选择其中经标准诱导治疗(全反式维甲酸和三氧化二砷的联合化疗)获得完全缓解(CR)、有完整临床和实验室资料的30例患者进行MRD检测，自获得CR起2年内每3个月、2年后每6个月收集标本1次，共112份(42份治疗前APL骨髓标本，70份APL-CR骨髓标本)骨髓标本。

1.2 方法

1.2.1 标本处理及核酸制备 抽取患者骨髓液EDTA 抗凝，取 100 μl加入 300 μl Trizol，-80 ℃以下保存备用。总RNA采用Trizol-氯仿—异丙醇—乙醇提取，将抽提好的RNA加至60 μl RNAase-free水混匀溶解，立即进行检测或-80℃以下保存备用。主要试剂和仪器为白血病融合基因检测试剂盒(上海源奇生物医药科技有限公司)、ABI Prism荧光定量PCR检测系统(美国)、FACSCalibur流式细胞仪及主要单克隆抗体HLA-DR-FITC、CD117-PE、CD123-Percpcy5.5、CD34APC(美国 BD 公司)。

1.2.2 RQ-RT-PCR方法 每份标本利用 Taqman探针在ABI Prism荧光定量PCR检测系统上同时检测PML-RARα和ABL基因的表达。以内参基因ABL检测 PML-RARα扩增的模板质量，用 PMLRARα融合基因两对引物分别扩增L型和S型2个不同的转录本。反应体系为25 μl(反应液8 μl加混合酶液2 μl和15 μl已抽提的 RNA)，扩增条件:42 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min;94 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。在PCR循环第2步60℃时收集荧光信号，检测通道为:FAM-TAMRA，参比荧光定为none。每组均设置阴性对照和阳性对照，最低检出限为1×102copies。每批标本均以阳性标准品质粒ABL 1×103～1×106个数量级范围作标准曲线。结果均以标准拷贝数(NCN)表示，即将同一份标本PMLRARα拷贝数/ABL拷贝数来计算PML-RARα转录本的相对表达量，单位为%。采用7500软件V2.0.1版本分析结果。

1.2.3 流式细胞术(FCM)检测 APL-CR患者的MRD 选择30份APL初诊时免疫表型符合HLADR-/CD117+/CD123+/CD34-的CR患者骨髓在进行RQ-RT-PCR检测的同时进行FCM检测MRD。四色直标，分析5×105个细胞，筛查 HLA-DR-/CD117+/CD123+/CD34-的细胞群。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计学软件，计数资料采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 APL患者的 RQ-RT-PCR结果 42例初诊APL患者的 PML-RARα融合基因转录本的中位NCN为61%(13% ～284%)，其中L型34例，S型8例。L型和S型异构体中位NCN分别为56%(28%～278%)和70%(13% ～284%)，L型和 S型转录本的表达水平无统计学差异(P＞0.05)。

2.2 RQ-RT-PCR检测APL-CR患者 MRD 70份APL-CR骨髓标本PML-RARα融合基因转录本中位NCN 为4.00%(0.00% ～8.26%)。其中有 26 份NCN≥0.01%，考虑有分子生物学复发风险。参照试剂盒说明书结果判断:NCN≥0.01%为MRD阳性，NCN＜0.01%为MRD阴性。

2.3 FCM检测APL-CR患者MRD FCM对符合要求的30份APL-CR骨髓进行MRD检测，其中有11例 CD34-/CD117+/CD123+/HLA-DR-细胞≥0.09%。MRD判断标准:根据实验室正常骨髓中此类细胞的比例在0.050% ～0.086%，确定 MRD≥0.09%为阳性，MRD ＜0.09%为阴性。

2.4 RQ-RT-PCR和FCM同时检测结果比较 30份骨髓标本，RQ-RT-PCR法检测MRD阳性14例，阴性16例;FCM法检测MRD阳性11例，阴性19例。两种方法均阳性10例，均阴性15例，符合率83.3%(25/30)。显示两种方法有较好的一致性(χ2=0.278，P=0.598)。

3 讨论

95%的APL患者有t(15;17)(q22;q21)染色体易位，形成PML-RARα融合基因，此为APL特异性细胞遗传学标志。但APL除了典型的t(15;17)外，少量患者存在t(11;17)和t(5;17)等其他涉及17号染色体的易位，这类患者对维甲酸治疗反应差，故早期正确检测PML-RARα融合基因，对明确诊断、指导治疗、提示预后具有重要的意义。

我们采用一步法RQ-RT-PCR，巧妙地将RT反应和随后的PCR反应融入一个体系中，大大减少了非特异性cDNA链的合成。整个反应完全在一个反应管中进行，一次加样后即可完成全部反应，最大限度减少实验操作，而且避免在加样过程中对反应产物造成污染。同时采用Taqman探针荧光定量技术，比定性PCR技术具有更好的特异性和灵敏度。融合基因转录本拷贝数以ABL内参基因进行标准化处理，从而校正了由于加样、探针荧光衰退等造成的误差，使结果更直观、可靠。本实验对42例初治APL患者检测了PML-RARα融合基因的L型和S型两种常见异构体类型，实验结果为L型34例，S型8例，转录本的中位NCN为61%(13% ～284%)。NCN值可直观地用来比较患者治疗前后的转录本表达水平变化。

随着治疗方案的改进，APL患者的生存期大大延长，但CR患者仍存在复发的危险，MRD的存在是导致复发的主要原因。曾有研究结果显示，MRD在0.5×10-5～5×10-5时与随后的复发无相关性［3］，即当 MRD＜10-5时已不能提示临床复发。RQ-RT-PCR技术敏感度达到10-6～10-4，可有效检测体内的残留白血病细胞［4］。本文通过对30例APL-CR患者的动态检测，70份骨髓标本的PMLRARα融合基因中位 NCN为 4.00%(0.00% ～8.26%)，明显低于初诊时。有26份PML-RARα融合基因 NCN≥0.01%，考虑有分子生物学复发风险。Jurcic等［5］认为PCR检测MRD 2次以上阴性的患者，仅7%发生复发，而2次以上阳性者则100%复发。因而，CR患者定期行RQ-RT-PCR检测有助于早期发现疾病进展，便于在血液学复发前进行挽救性治疗。

文献报道［6］与本室结果证实，APL具有较特异的免疫表型:SSC较大，CD34、HLA-DR都为阴性，CD117表达率达80%左右。CD123是APL干细胞的一个独特的标志，正常造血干细胞极少表达，因此，利用 CD34-/CD117+/CD123+/HLA-DR-抗体组合可有效地对符合该表型的APL-CR患者进行MRD检测。选择其中30份初诊时符合该免疫表型的骨髓标本利用FCM检测MRD，发现两者有较好的一致性。本组有4例临床缓解标本FCM检测结果为阴性，而RQ-RT-PCR检测到PML-RARα融合基因转录本，可能与RT-PCR敏感性高于FCM有关。1例FCM检测到MRD而RQ-RT-PCR结果为阴性，与其存在一定的假阴性有关。

综上所述，以Taqman探针荧光定量技术，用ABL为内参基因的一步法RQ-RT-PCR不仅操作简便、检测快速，而且结果直观、可靠，具有很好的灵敏度和特异性，在APL诊断和MRD的检测中具有重要的临床价值。

［1］Melo RA，de Vasconcellos JF，Melo FC，et al.PML-RARalpha fusion gene transcripts and biological features in acute promyelocytic leukemia patients［J］.Clin Lab Haematol，2006，28(2):126-129.

［2］Gonzalez M，Barraqan E，Bolufer P，et al.Pretreatment characteristics and clinical outcome of acute promyelocytic leukemia patients according to the PML/RAR alpha isoforms:a study of the PETHEMA group［J］.Br J Haematol，2001，114(1):99-103.

［3］Roberts WM，Estrov Z，Ouspenskaia MV，et al.Measurement of residual leukemia during remission in childhood acute lymphoblastic leukemia［J］.N Engl Med，1997，336(5):317-323.

［4］Gallagher RE，Yeap BY，Bi W，et al.Quantitative real-time RTPCR analysis of PML-RAR alpha mRNA in acute promyelocytic leukemia:assessment of prognostic significance in adult patients from intergroup protocol 0129［J］.Blood，2003，101(7):2521-2528.

［5］Jurcic JG，Nimer SD，Scheinberg DA，et al.Prognostic significance of minimal residual disease detection and PML/RARα isoform type:long-term follow-up in acute promyelocyetic leukemia［J］.Blood，2001，98(9):2651-2656.

［6］沈红强，汤永民，宋华，等.CD117/CD11b在急性早幼粒细胞白血病不同病期的表达变化［J］.中国实验血液学杂志，2006，14(4):644-648.