食管鳞癌 Bmi-1蛋白表达与化疗疗效的关系

魏 玲，李苏宜，孙三元，袁保兰，孙 丽

(1徐州市中心医院，江苏徐州 221009;2东南大学附属中大医院)

Bmi-1基因广泛表达于多种类型干细胞，参与造血干细胞和神经干细胞的自我更新，高表达 Bmi-1蛋白细胞被认为是肿瘤中存在的肿瘤干细胞[1]。本研究通过免疫组化方法检测 Bmi-1蛋白在食管鳞癌组织中的表达，并探讨其与食管鳞癌化疗疗效的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集徐州市中心医院 2002～2008年保存的食管鳞癌石蜡标本 30例，病例均经病理学确诊，术后均出现复发转移。给予铂类药物联合方案化疗，化疗后完全缓解 +部分缓解 11例(CR+PR组)，稳定 9例(SD组)，进展 10例(PD组)。

1.2 方法 每个蜡块取 4μm厚连续切片做免疫组化染色。先将切片置于二甲苯中脱蜡，乙醇梯度水化处理，柠檬酸缓冲液抗原煮沸修复，滴加鼠抗人Bmi-1单克隆抗体(1∶50，英国 Abcam公司)，37℃孵育1 h，滴加二步法免疫组化检测试剂山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体(北京中杉公司)，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇固定，封片、观察。用 PBS代替一抗做阴性对照。

1.3 结果判断 Bmi-1蛋白阳性表达主要表现为细胞核内呈现棕黄色或者棕褐色颗粒。高倍镜下随机取 4个不同的视野，计数细胞总数及核阳性细胞数，按阳性细胞所占的百分比计分。阳性细胞率≤10%为 1分，＞10% ～≤50%为 2分，＞50% ～≤75%为 3分，＞75%为 4分。同时，根据染色的强弱程度计分。阴性染色 1分，弱染色 2分，中等强度染色 3分，强染色 4分。根据阳性细胞率和染色强弱计分的乘积判断结果:≤4为(-);＞4～≤8为(+);＞8～≤12为(++);＞12～≤16为(+++)。统计分析时(-)和(+)合计为阴性表达，(++)和(+++)合计为阳性表达。以上结果均至少由两位病理科医生以双盲法观察确定。

1.4 统计学方法 SPSS13.0统计软件对实验数据用 R×C表Fisher's Exact Test进行分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Bmi-1蛋白在食管鳞癌组织中的表达 Bmi-1蛋白阳性表达主要为细胞核内出现棕黄色颗粒。Bmi-1蛋白在食管鳞癌标本中的阳性表达率为23.3%(7/30)。

2.2 Bmi-1蛋白在食管鳞癌组织中的表达与铂类药物联合化疗疗效的关系 Bmi-1蛋白在 PR+CR组阳性表达率为 36.36%(4/11)，在 SD组阳性表达率为 11.11%(1/9)，在PD组阳性表达率为20.00%(2/10)。各组 Bmi-1蛋白阳性表达率比较差异无统计学意义(P＞0.05)，食管鳞癌 Bmi-1蛋白表达与铂类药物联合化疗疗效无关。

3 讨论

Bmi-1基因是一种致癌基因，属于多巯基因家族成员，首次被提出是在 1991年转基因鼠的淋巴瘤细胞传代中，作为一种原癌基因与另一种癌基因 cmyc协同作用引起细胞转化和肿瘤形成[2]。高表达Bmi-1的细胞被认为是肿瘤中存在的肿瘤干细胞。最近，Umar[3]研究认为，肠干细胞存在于 Bmi-1阳性的肠隐窝。肿瘤干细胞是肿瘤细胞群体中具有部分干细胞特性的细胞亚群，其增殖能力明显强于同一肿瘤组织中的其他癌细胞，在肿瘤的发生、发展和维持中起十分重要的作用。肿瘤干细胞的概念第 1次被提出是在急性粒细胞白血病的研究中，认为肿瘤干细胞是来自恶性白血病干细胞的异常造血组织。肿瘤中存在 ＜1%的肿瘤干细胞，它们通过分裂和增殖产生具有自身表型的子细胞及其分化细胞。肿瘤细胞能够分离出不同亚群并可显示某一亚群具有高度的克隆能力则证实了这一假说。研究表明，肿瘤干细胞与肿瘤出现转移、抗药性的产生以及治疗后的复发转移有密切关系。Dirks[4]已经报道，Bmi-1低表达的肿瘤细胞有较低的侵袭性，因为它有较少的干细胞。目前新的研究证实，恶性肿瘤中存在肿瘤干细胞，肿瘤干细胞抵抗治疗，导致治疗失败，使肿瘤复发[5]。Bmi-1在肺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌等多种肿瘤中呈高表达，并且 Bmi-1的表达在转录水平和翻译水平的上调与肿瘤的不良预后密切相关。覃丽在鼻咽癌的实验中通过 Hoechst33258染色和流式细胞仪检测显示抑制内源性 Bmi-1的表达能增加 5-Fu所诱导的凋亡效应，Bmi-1干扰能增加鼻咽癌细胞对化疗药 5-Fu的敏感性;干扰 Bmi-1能显著抑制 AKT的活性，上调 Bax的表达并下调Bcl-2的表达;Bmi-1干扰能通过 P13K/AKT途径增加 5-Fu诱导的鼻咽癌细胞的凋亡。在急性髓细胞性白血病研究中发现，Bmi-1基因的高表达不利于AML患者获得良好的治疗效果，提示 Bmi-1基因表达水平可以作为部分肿瘤患者疗效预测指标之一[6，7]。对肺癌患者的研究也证实，大量表达的Bmi-1基因产物不利于肺癌患者从化疗中获益[8]。Qin等[9]在鼻咽癌的研究中发现，低表达 Bmi-1基因的肿瘤细胞对化疗药物 5-Fu敏感，该效应与促进5-Fu诱导的细胞凋亡有关。上述研究提示Bmi-1干扰联合化疗药物能提高化疗敏感性，也就是说，高表达 Bmi-1的肿瘤细胞易产生化疗耐药。

本研究结果显示，Bmi-1蛋白表达与以铂类药物为基础的联合化疗疗效无相关性，Bmi-1蛋白不能成为预测化疗敏感性的指标，与以上有关研究结果不一致。由于本次实验样本例数少，Bmi-1表达与食管鳞癌化疗敏感性的关系仍需进一步研究。

[1]Jacobs JJ，Scheijen B，Voneken JW，et al.Bmi-1 collaborates with c-myc in tumorigenesis by inhibiting c-myc-induced apoptosis via INK4a/ARF[J].Genes Development，1999，13(20):2678-2690.

[2]Haupt Y，Alexander WS，Barri G，et al.Novel zinc finger gene implicated asmyc collaborator byretrovirally accelerated lymphomagenesis in Emu-myc transgenic mice[J].Cell，1991，65(5):753-763.

[3]Umar S.Intestinal stem cells[J].Curr Gastroenterol Rep，2010，12(5):340-348.

[4]Dirks P.Bmi-1and cell of origin determinants of brain tumor phenotype[J].Cancer Cell，2007，12(4):295-297.

[5]Li C，Lee CJ，Simeone DM.Identification of human pancreatic cancer stem cells[J].Methods Mol Biol，2009，568(11):161-173.

[6]Mihara K，Chowdhury M，Nakaju N，et al.Bmi-1 is useful as a novel molecular marker for predicting progression of myelodysplastic syndrome and patient prognosis[J].Blood，2006，107(1):305-308.

[7]Sawa M，Yamamoto K，Yokozawa T，et al.BMI-1 ishighly expressed in M0-subtype acute myeloid leukemia[J].Int J Hematol，2005，82(1):42-47.

[8]Vrzalikova K，Skarda J，Ehrmann J，et al.Prognostic value of Bmi-1 oncoprotein expression in NSCLC patients:a tissue microarray study[J].J Cancer Res Clin Oncol，2008，134(9):1037-1042.

[9]Qin L，Zhang X，Zhang L，et al.Downregulation of BMI-1 enhances 5-fluorouracil-induced apoptosis in nasopharyngeal carcinoma cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，371(10):531-535.