PCR-RFLP和微卫星DNA标记法在棘球绦虫感染诊断中的应用

刘春燕,马秀敏,丁剑冰,谌宏鸣

(新疆医科大学高职学院,乌鲁木齐 830006)

包虫病是棘球绦虫的幼虫寄生于人及某些动物等宿主体内所致的一种严重的人畜共患性疾病。在不同的宿主中,棘球绦虫存在着实质性的基因遗传差异,为此采用基因诊断方法具有重要的诊断价值[1]。本研究采用PCR-RFLP和微卫星DNA标记法对包虫病棘球绦虫分离株的基因型进行鉴定,希望为棘球绦虫的实验室诊断寻找一种快速有效分子生物学检测方法。

1 材料与方法

1.1 标本来源 40个包囊标本来自 40例包虫病患者(男 22例、女 18例,年龄 18～65岁,汉族 32例、蒙古族5例、回族2例、维吾尔族1例)。无菌取囊组织,用生理盐水漂洗后加入 95%的乙醇保存,以 1个包囊为 1个分离株。

1.2 引物合成 PCR-RFLP方法：在Genebank中查询棘球绦虫线粒体DNA基因序列,根据其他研究报道的基因序列,用DNAman软件辅助设计上、下游引物。rrnl上游引物为5′-GGTTTATTTGCCCCGCATCATGC-3′,下游引物为5′-ATCACGTCAAACCATTCAAACAAGC-3′,扩增长度为561 bp。微卫星DNA标记法：参照文献和检索Genebank中棘球绦虫微卫星位点,设计棘球绦虫微卫星位点基因引物,正向引物5′端分别标记不同显色的荧光。Sea上游引物为5′-CGAAAGTGATGACAAACCAA-3′,下游引物为5′-CGTTGATGGAGATGAGGTCG-3′,扩增长度为561 bp。两组引物由日本Genosys公司合成并标记。

1.3 DNA的提取 取包虫病患者的包囊组织约25 mg,置培养皿中,漂洗 2遍后放入离心管中,严格按DNA提取试剂盒说明书操作,提取基因组DNA。

1.4 PCR扩增 PCR-RFLP方法：以棘球绦虫DNA为模板,加入引物,按常规方法扩增基因片段。扩增参数：94℃预变性2 min,94℃变性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸2 min。每次反应均设立不含DNA模板的阴性对照和已知棘球绦虫DNA的阳性对照。微卫星DNA标记法：以提取的棘球绦虫DNA为模板,加入荧光引物,按常规方法扩增棘球绦虫三位点微卫星序列。扩增参数：94℃、1mim,94℃、30 s,55℃、30 s,72℃、30 s, 35个循环;72℃延伸5 min。每次反应均设立不含DNA模板的阴性对照和已知棘球绦虫DNA模板的阳性对照。

1.5 数据分析 采用GeneSean5.1软件进行电泳图象扫描和收集分析DNA片段,结合Genotype软件分析收集的数据进行基因分型。

2 结果

以棘球绦虫DNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,可得到大小约为561 bp的扩增条带,产物的长度与引物设计的预期产物长度一致,且条带清晰。以棘球绦虫DNA为模板,用Sea引物进行PCR扩增,可得到约90 bp的扩增条带,产物的长度与引物设计的预期产物长度一致,且条带清晰,说明PCR产物可信,可用来进行基因扫描。40个分离株标本经荧光PCR及微卫星标记鉴定均为细粒棘球绦虫,其中 39个细粒棘球绦虫分离株标本为细粒棘球绦虫 G1基因型,1个分离株标本为细粒棘球绦虫G6基因型。荧光 PCR及微卫星标记鉴定结果与DNA序列分析基因型结果完全一致。

3 讨论

棘球绦虫属于扁形动物门的绦虫纲,其成虫寄生于犬科肉食动物小肠内,呈扁平带状小型寄生虫,幼虫寄生于人或其他动物的肝、肺等器官中引起囊型包虫病[2]。棘球绦虫呈世界性分布,由于其由大量内部变异的虫株组成,在不同的地理环境和宿主中,棘球绦虫的虫株不同,对人群的传播动力学、致病性、抗原反应、化疗反应等不同。因此,对棘球绦虫虫株的鉴定及种内变异性的研究,可指导包虫病的诊断、抗包虫病药物的选择、疫苗的研制等[3]。已发现棘球绦虫感染与犬肠内局部升高的免疫力之间有关联,有研究通过对新疆家犬小肠内棘球绦虫的大体观察及DNA检测,发现家犬存在棘球绦虫和多房棘球绦虫混合感染[4]。

微卫星DNA是新近发现的一种DNA遗传学标志,具有易于筛选、种类繁多、分布广泛、高度多态性、重组率低和在种群中表现出高度的个体特异性等特点。荧光PCR结合基因扫描基因分型法更加快速准确,实现了全部操作自动化,方法简单易行,需要的扩增产物量少、灵敏度高、重复性好、信息量大,适用于大规模群体遗传学研究及流行病学调查[5]。本研究以棘球绦虫的Sca微卫星序列为分型标记,利用荧光PCR基因扫描技术鉴定包虫病患者棘球绦虫分离株的基因型和杂合度,多个微卫星标志联合分析可提高基因分型的鉴别力。纯合子的PCR产物由相同碱基序列的DNA片段组成,而杂合子的PCR产物则包括两种不同长度的DNA片段,长度差异由核心序列的不同串联重复数引起,通过精确测定PCR产物长度就能确定微卫星基因型[6]。本实验结果表明,39个细粒棘球绦虫分离株标本为细粒棘球绦虫 G1基因型,1个分离株标本为细粒棘球绦虫G6基因型,微卫星标记鉴定结果与DNA基因型序列分析结果一致。在本研究中未发现棘球绦虫的杂和现象,可能是棘球绦虫大多为自体受精,发生杂合现象的机会较少所致。

随着寄生虫分子遗传学的发展,现已从研究细粒棘球绦虫的表型发展到研究其基因型。PCRRFLP以其简单、敏感、可靠、价廉、所需样品量少、无需同位素等优点为研究者们所接受[7]。本研究采用PCR-RFLP扩增棘球绦虫rrnl基因序列,该序列长度为561 bp。PCR-RFLP对棘球绦虫的基因型鉴别与DNA序列分析鉴别结果符合率达100%。

总之,PCR-RFLP方法和微卫星DNA标记法是简单、快速、有效的棘球绦虫基因型检测诊断方法。但其在寄生虫学方面的应用目前还处于初始阶段。

[1]冯笑梅,王希良.棘球蚴基因片断的克隆与序列分析[J].中华医学研究杂志,2002,2(4)：295-297.

[2]Veneziano V,Rinaldi L,Apicella G,et al.Cystic echinoeoccosis in the campamlia region(southern italy)[J].Parasitologia,2004,46 (4)：449-451.

[3]李丽,夏清,付大仁,等.宁夏回族自治区农村人群包虫病流行病学调查[J].中国人兽共患病杂志,2005,21(4)：359-360.

[4]丁木拉提,郭永忠,高永盛,等.新疆自治区尼勒克县乌拉斯台乡包虫病流行病学调查[J].中华流行病学杂志,2005,26(2)：131.

[5]姚明琴,师茂林.1213例包虫病住院病例的回顾性调查分析[J].地方病通报,2004,19(4)：68-69.

[6]姜礼,何国华.手术治疗肝包虫的临床体会[J].中国寄生病防治杂志,2004,17(2)：4.

[7]杨圆尧,徐建华,钟丽玲.340例住院寄生虫病例的回顾性调查分析[J].中国寄生虫病防治杂志,2004,17(2)：102.