鞘氨醇单胞菌在生物降解方面的研究进展

台喜生，冯佳丽，李 梅，李师翁

（兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070）

鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonassp.）[1]属于变形菌门（Proteobacteria）的α-4-亚门，细胞膜组成中含有鞘糖脂，是典型的好氧，化能自养，革兰氏阴性，杆状，通常菌落呈黄色的细菌。鞘氨醇单胞菌广泛分布于水生和陆生环境中。鞘氨醇单胞菌属的很多种可以降解多种化合物，如联苯（含取代基的）萘、芴（含取代基的）菲、芘（含氯的）联苯醚（含氯的）呋喃、咔唑、聚乙二醇、氯化酚和多种除草剂以及杀虫剂，在环境微生物学领域受到越来越多的关注。

1 鞘氨醇单胞菌生物降解的研究现状

1.1 特殊的代谢机制

鞘氨醇单胞菌属的不同种具有不同的代谢机制，因此可以降解多种有机化合物，证明该属细菌可以比其他细菌属的细菌更快更有效地适应新化合物污染的环境。这种降解能力与通常的矿化降解机制不同。对（含取代基的）萘或联苯降解途径的生理和酶学研究表明，鞘氨醇单胞菌与其他降解细菌并不存在显著性差异。但是对于降解2，4-D或联苯的编码基因的研究表明，鞘氨醇单胞菌属细菌和其他变形菌门细菌只存在低水平的序列相似性。这说明在降解机制的进化过程中，鞘氨醇单胞菌与其他变形菌门细菌之间出现差异。

鞘氨醇单胞菌与其他革兰氏阴性菌的主要区别是，通常可以在鞘氨醇单胞菌中发现不同寻常的降解基因的组成。之前关于假单胞菌的研究表明，编码降解酶的基因一般位于相同的操纵子中，并且被协同调控，这种基因调控的经典例子是降解氯化邻苯二酚的TOL或NAH质粒编码的是间位裂解途径，而其他质粒编码的是改进的邻位裂解途径，或者是染色体编码的β-氧化己二酸途径。相比之下，鞘氨醇单胞菌属细菌的降解途径的编码基因的定位是彼此分开的，或者至少是由协同管理的不同操纵子调控的。

1.2 多样的降解基因

鞘氨醇单胞菌属的不同种已被证实可以降解多种有机污染物[2]，包括难降解化合物，如氯化外源性物质，二恶因和多环芳烃（PAHs）。鞘氨醇单胞菌的这种出众的能力使其在生物修复和分解代谢酶学的研究领域中具有重要价值。对于不同PAH的降解菌株的独立基因分析揭示它们含有一系列独特的分解代谢基因，通常位于大质粒上，大质粒对于鞘氨醇单胞菌多样的代谢机制具有重要意义。研究表明，超过40 kb的DNA序列，即主要的降解基因簇，包括在单芳香族化合物的分解代谢中起作用的xyl基因，被降解多环底物的功能基因（bph，nah，ahd或phn）打断。这一独特的基因序列在不同地区分离的鞘氨醇单胞菌属菌株之间是保守的。

近年来许多质粒被分离并表明其上的基因编码的酶可以降解有机外源性物质。其中一些质粒存在于假单胞菌中，被划分为不相容的p组（IncP）[3]。多种鞘氨醇单胞菌也被鉴定为异型生物质的分解者，不同种类具有分解苊、联苯、萘、咔唑、dibenzop-dioxin和许多其他化合物的能力。降解基因的序列和组成在不同种的鞘氨醇单胞菌之间具有显著的相似性，但是与假单胞菌不同。大质粒在可降解异型生物质的鞘氨醇单胞菌中是普遍存在的，尽管这些质粒对降解具有重要意义，但是很少有研究报道鞘氨醇单胞菌质粒的全序列，因此，很有必要研究鞘氨醇单胞菌的质粒，以便更好地理解它们的功能、种类和分子进化。

1.3 高活性的降解酶

多拷贝的编码Rieske型加氧酶[4]的末端成分的基因是鞘氨醇单胞菌属所特有的，通常发现在降解芳香烃的其他细菌中，可以编码两个同源电子载体的该多拷贝基因与加氧酶的编码基因是毗邻的，而在鞘氨醇单胞菌中并非如此。Rieske型加氧酶可以催化不同芳香族化合物的二羟基化反应，通常也是有氧生物降解污染物的起始酶。它们组成一个2或3聚体金属酶的大家族。该金属酶的催化成分通常是一个杂聚肽α3β3六聚体，包含一个Rieske型[2Fe-2S]簇，每个α亚基有一个非亚铁血红素的铁原子。最近在Sphingomonassp.菌株CHY-1中发现该酶是作用于PAHs的起始酶，该菌株可以以chrysene为唯一碳源生长。

在一个三聚体酶的复合体中，加氧酶PhnⅠ[5]，与一个 NAD（P）H氧化还原酶（PhnA4）和一个铁氧化还原蛋白（PhnA3）共同行使催化功能，该酶可以氧化多种2-5个环的PAHs。分析研究了一个（PhnA）基因敲除的突变体，证实PhnⅠ是降解菌株能在PAHs上生长所必需的。没有其他酶可以代替PhnⅠ行使最初使PAHs发生二羟基化反应的功能。

另一个加氧酶PhnⅡ，催化水杨酸盐C-1羟基化形成邻苯二酚在菌株CHY-1中已被证实，当在大肠杆菌中形成重组体大量表达时，PhnⅡ需要与辅酶PhnA4和PhnA3共同表达才能拥有全活性。说明PhnⅡ是一个三聚体酶，并且与PhnⅠ共享电子载体。PhnⅡ与来自Ralstoniasp.菌株U2的水杨酸盐5-羟化酶相类似，该酶可以把水杨酸盐氧化成龙胆酸盐。但是PhnⅡ与假单胞菌中水杨酸盐1-羟化酶不同，该酶是单体黄素蛋白。

三聚体水杨酸盐1-羟化酶最初报道是在Sphingomonassp.菌株P2中发现的，该菌株可降解菲。该菌株合成三个与PhnⅡ同源的同功酶，对不同取代的水杨酸盐体现特异性。在Sphingomonas yanoikayaeB1中，一个类似的羟化酶可以催化水杨酸盐羟基化反应并转化1-羟基-2-苯甲酸盐生成1，2-二羟萘。研究发现Sphingomonassp.菌株AO1[6]中含有最初羟基化双酚A（BPA）的细胞色素P450单氧酶系统。许多细菌细胞色素P450单氧酶系统是Ⅰ级系统，包含FDA的NADH依赖型还原酶（铁氧化还原蛋白还原酶）和一个铁-硫固氮铁蛋白（铁氧化还原蛋白）。这些细胞色素P450单氧酶系统可以催化羟基化、环氧化、硫化氧化或脱烷基化作用而降解多种异型生物质的化合物，如药物、香水、致癌物和杀虫剂。

藻朊酸盐是一个线性多糖，由α-L-古罗糖醛酸（G）和它的C5差向异构体β-D-mannuronate（M）组成，有三种排列方式：多聚-α-L-古罗糖醛酸[poly（G）]，多聚-β-D-mannuronate[poly（M）]和异多聚体[poly（MG）]。藻朊酸盐裂解酶通过β-消除反应裂解藻朊酸盐。多数藻朊酸盐裂解酶，来源于从细菌到海洋动物等生物。以最初结构为基础，多糖裂解酶被划分为13个族。大多数藻朊酸盐裂解酶被划分进两个族，即PL-5和PL-7。总的来说，藻朊酸盐裂解酶在PL-5和PL-7族中能分别较好地解聚poly(M)和poly(G)。有研究者研究了Sphingomonassp.菌株A1[7]细胞中藻朊酸盐的代谢机制。最近，该菌株完整的基因序列被检测，分析表明：该菌株通过一个“超级通道”吸收高分子（藻朊酸盐），该“超级通道”由一个细胞表面的深坑和一个深坑-依赖型的ABC载体，通过3个细胞内藻朊酸盐裂解酶（A1-Ⅰ，A1-Ⅱ，A1-Ⅲ）和胞外藻朊酸盐裂解酶催化的协同的酶促反应解聚藻朊酸盐成其单糖。这三个细胞内藻朊酸盐裂解酶是由单个基因编码的，并且前导蛋白A1-Ⅰ自催化产生A1-Ⅱ和A1-Ⅲ。A1-Ⅱ和A1-Ⅲ被分类进PL-7和PL-5族，分别催化 poly（G）和 poly（M）。因此，A1-Ⅰ是一个混合酶且具有PL-5和PL-7族裂解酶的特性。研究者认为，A1-Ⅱ和A1-Ⅲ分别是PL-7和PL-5族藻朊酸盐裂解酶的最初个体。A1-Ⅱ和A1-Ⅲ的基因源于A1-Ⅰ的基因，通过复制、修饰和易位独立地形成属于PL-7和PL-5族裂解酶的基因。

2 鞘氨醇单胞菌生物降解的研究进展

2.1 国外研究进展

PAHs主要是由燃烧和与石油有关的人类活动引起的。已经分离出许多微生物可以以PAHs作为唯一碳源和能源物质生长，而且利用这些微生物进行生物修复被广泛关注。

鞘氨醇单胞菌[8]之所以被集中地研究，是因为它们可以降解多种芳族烃。降解芳香族化合物的基因通常分散于整个基因组，由有限的操纵子调控，所以在不同种类的鞘氨醇单胞菌中PAHs的降解基因的功能和组成通常是保守的。研究表明，革兰氏阴性菌质粒上成簇的降解基因编码的加双氧酶是降解PAHs的主要酶。最近，Sphingomonas sp.菌株KA1的降解质粒pCAR3上具有同源于dbfA1和dbfA2的基因，这两个基因是在降解芴和氧芴的杆菌属（Terrabacter sp.）菌株 DBF63中发现的，它们编码一种有角的加双氧酶复合体。

咔唑（CA）是一种含N的杂环化合物，来源于木馏油、原油和页岩油，有毒性和致突变活性。不同种属的分离菌株被报道可以降解这种残留时间长的化合物。多数分离菌株具有相同的CA降解途径，首先在它的角位置被加双氧酶攻击，然后自发地从双氧化酶的中间体转变到2-苯基苯胺-2，3-二醇，然后一个雌二醇加双氧酶攻击羟化环的活动部位，最终产生 2-羟基-6-（2-氨基苯）-6-氧-2，4-己二烯酸，这种不稳定的裂解产物水解产生邻氨基苯甲酸。一株Sphingomonas sp.菌株XLDN2-5[9]可以以咔唑为唯一碳源、氮源和能源生长。XLDN2-5可以降解氧芴（DBF）生成2-羟基-6-（2-羟基苯）-6-氧-2，4-己二烯酸，随后通过有角加双氧酶途径生成水杨酸。XLDN2-5可以通过环裂解和磺化氧化作用途径转化硫芴（DBT）。

壬基苯酚（NP）和辛基苯酚（OP）属于烷基酚，是清洁剂分解产物，有高度分支化的侧链，有较弱的雌激素活性，可以扰乱内分泌系统。因为烷基酚对鱼类和其他水生生物有害，已引起广泛关注。已有报道有些微生物在有氧条件下可以降解NP和OP。对特异NP异构体的生物降解机制在Sphingomonas sp.菌株TTNP3[10]中被研究，降解基因为Ⅱ型ipso的不同代替物。在NP上生长局限于烷基侧链含有完全取代的α碳的那些异构体。Sphingomonas sp.菌株TTNP3利用单氧酶转化NP。Sphingomonas sp.菌株PWE1[11]的降解基因在大肠杆菌中表达的活性物质可将OP转化成对苯二酚（HQ）。

迄今为止，氧化降解六六六（HCH）的细菌多为少动鞘氨醇单胞菌和Rhodanobacter lindaniclasticus。HCH降解菌株在世界上不同地区均有被分离出的例子。少动鞘氨醇单胞菌SS86分离自日本，少动鞘氨醇单胞菌B90A分离自印度，R.lindaniclasticus菌株分离自法国。这三株细菌具有显著的相似性，都可以降解HCH的不同异构体α-HCH，γ-HCH，δ-HCH。HCH降解过程的代谢途径和编码基因在少动鞘氨醇单胞菌UT26[12]中被深入研究，γ-HCH降解的起始酶是HCH脱氯化氢酶，由基因lin A编码，γ-HCH降解过程的其他基因是lin B，lin C，lin D和lin E，分别编码halidohydrolase，脱氢酶，还原dechlorinase和加双氧酶。此外，基因lin X编码一种蛋白和Lin C具有相同的活性。

异丙隆（IPU）在土壤中降解缓慢，可以从土壤中被过滤而污染水资源。研究表明，鞘氨醇单胞菌可以通过尿素侧链连续地N-脱甲基作用降解异丙隆，随后通过矿化苯基-尿素结构而降解异丙隆，但是为了广泛地降解液体培养或农业土壤中的IPU,Sphingomonas sp.菌株SRS2[13]需要与其他菌株共培养才能完成此过程，或者通过添加氨基酸的方法，并且土壤pH对IPU降解的空间变异性具有重要影响。

环境金属污染物是一个严重的问题，从废弃物中处理、回收目标金属是一个重要挑战。有效地固定放射性金属对于阻止地下水污染是很关键的。酶促生物沉淀低浓度重金属不会受制于化学技术是一个相当经济和环境友好型的策略。在细菌、古生菌、酵母、植物和哺乳动物细胞中碱性磷酸酶普遍存在并且高产，但它们应用于金属-磷酸盐沉淀的开发应用报道较少。有研究者将鞘氨醇单胞菌碱性磷酸酶[14]的编码基因克隆到大肠杆菌体内，经高效表达以后应用于碱性溶液中铀的沉淀。

2.2 国内研究进展

Kuaikuai Chen 等[15]研究了Sphingomonassp.菌株DPS8对PCA的生物降解，反应后只产生少量代谢物，代谢物用HPLC分离，然后通过BSTFA和NMR提取，用GC-MS鉴定，结果为HPAEC和HPAC，即鞘氨醇单胞菌株DPS8降解PAC后产生HPAEC和HPAC。

邻苯二甲酸酯（PAEs）污染水体、大气和土壤已成为许多国家关注的重要环境污染问题。在研究PAE生物降解途径的同时，PAE降解菌株的分离成为一个关注的焦点。Ping Zeng等[16]从邻苯二甲酸（PA）好氧降解颗粒中分离出了Sphingomonassp.菌株PA-02，菌株PA-02具有降解PAE的能力而无迟缓期。生长测试结果显示，菌株PA-02也可以降解邻苯二甲酸二甲酯（DMP）。

欧阳主才等[17-18]从广州市郊区土壤中分离得到一株鞘氨醇单胞菌属菌株XJ，通过富集培养的方法提高其对有机磷、氨基甲酸酯和除虫菊酯类农药的生物降解效率，利用气相色谱测定，最终获得该菌株对克百威、异丙威、辛硫磷、毒死蜱和氯氰菊酯的降解率，分别为：55.58%、62.74%、77.55%、56.59%和81.8%，表明菌株XJ对有机磷、氨基甲酸酯和除虫菊酯类农药具有良好的降解效果，因此对农药污染的环境具有很好的生物修复功能。

国内对于鞘氨醇单胞菌生物降解功能的研究中多选用菲和溴氨酸作为鞘氨醇单胞菌进行生物降解的底物。陶雪琴[19-20]等研究了鞘氨醇单胞菌属菌株GY2B降解菲的特性及其对多种芳香有机化合物的代谢，表明菌株GY2B降解高浓度的菲会积累大量的中间产物1-羟基-2-萘酸。菌株GY2B降解水杨酸和1-羟基-2-萘酸以及萘的过程中均检测到2-羟基粘康半醛的吸收峰，说明该菌株可能通过相同的途径降解这3种化合物。菌株GY2B降解菲的过程也会生成2-羟基粘康半醛这种中间产物。这证明菌株GY2B先通过水杨酸途径，再经过邻苯二酚间位途径来降解菲。

林文莲等[21]研究了鞘氨醇单胞菌对溴氨酸的好氧降解，结果表明，溴氨酸主要通过蒽醌环断裂直接生成终产物2-氨基-3-羟基-5-溴苯磺酸或2-氨基-4-羟基-5-溴苯磺酸，仅有少量溴氨酸在降解过程中形成中间产物邻苯二甲酸。

3 展 望

目前，对于鞘氨醇单胞菌生物降解功能的研究多限于实验室的摇瓶培养，通常在基础盐培养基中添加欲降解的目标底物，或者在摇瓶中添加污染的土样或水样，构建类污染环境进行降解研究，而环境污染往往需要原位修复，所以，今后鞘氨醇单胞菌生物降解功能研究可以尝试面向已污染土壤或水体的原位修复。鞘氨醇单胞菌能耐受贫营养环境，环境适应性强，对多环芳烃类、农药类等难降解的环境污染物均有很好的生物降解效果，无二次污染，在实验室研究的基础上应用到实际的环境生物修复工程中，将会为人类解决环境污染问题提供巨大的帮助。

鞘氨醇单胞菌对PCA，PAHs，PAEs、农药等环境污染物的生物降解多限于降解产物的鉴定，而对生物降解途径的研究不够透彻，并且反应动力学也有待研究分析，对参与生物降解途径的酶及编码基因的研究也有很多未涉及的领域，基因工程的运用将拓宽鞘氨醇单胞菌生物降解功能基因的应用，不同菌株之间构建“超级菌”会有很好的应用前景。

现在的研究多关注有机化合物的化学代谢途径，降解酶和编码基因同样备受关注，但是对于生物修复的固定化方法研究较少。固定化微生物比自由细胞在生物转化过程中的稳定性更高，并且有助于回收和再利用，但是底物向反应系统扩散的质量传递限制仍然是这种截留技术的主要缺点。纳米离子的尺寸（1～100 nm）使它们具有大的比表面积和高比能，在原位或非原位修复中均能发挥作用。鞘氨醇单胞菌的固定化结合纳米技术在环境污染的生物修复中很有前景。

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