拟南芥COI1基因在茉莉素信号传导中的作用

陈 艳，任春梅,2

(1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；

2.作物基因工程湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

茉莉素（jasmonates，JAs）是一类发现较晚的植物激素，它包括茉莉酸（jasmonic acid，JA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）以及由茉莉酸衍生的其他一系列具有相似生物活性的化合物。茉莉素能调节许多植物生长发育过程，包括根生长、雄蕊发育、块茎形成、衰老和果实成熟等，介导植物对生物和非生物胁迫的抗逆反应，如：机械伤害、昆虫侵害、病原菌侵染和紫外线损伤等。因此，茉莉素对植物的生存至关重要。在拟南芥中，如果茉莉素的生物合成或者信号传导受阻，植株会因雄性不育而无法完成生命周期。同时，植株也会因失去对逆境(如昆虫侵害、病原菌侵染等)的抗性而无法生存。在茉莉素信号传导中，COI1基因起着非常重要的作用。缺失该基因的拟南芥植株丧失了所有的茉莉素反应，表现为雄性不育、易感染病虫害等。

1 COI1基因突变对茉莉素信号传导的影响

1994年Feys[1]等筛选获得了对植物毒素冠菌素（COR，COR）不敏感的拟南芥突变体coi1（COR-insensitive1）。冠菌素是假单胞菌分泌的一种致病毒素，与茉莉素具有相似的化学结构和生物活性。他们发现筛选出的所有coi1突变体都对茉莉酸甲酯不敏感，并且表现为雄性不育。随后的研究发现coi1突变体易感病虫害，而且失去了对茉莉素的正常反应，如茉莉素诱导的基因表达，茉莉素诱导的花青素积累和侧根形成等。

1998年Xie等[2]采用图位克隆法分离出拟南芥COI1基因。该基因编码一个含有592个氨基酸的F-box蛋白。在coi1-1突变体中，编码COI1蛋白第467个氨基酸色氨酸的密码子突变成了终止密码子，从而形成没有功能的COI1蛋白片断。因此，coi1-1突变体完全失去茉莉素介导的生物功能，表现为完全雄性不育、易感病虫害、不表达茉莉素诱导基因等。而在COI1弱突变体coi1-2中，COI1蛋白的第245个氨基酸由亮氨酸变成了苯丙氨酸，表现为部分地丧失了COI1的功能。与野生型植株相比，coi1-2突变体虽然对茉莉素的反应以及对病虫害等逆境的敏感性都极显著地降低，但对茉莉素仍有轻微的反应，表现为部分不育、能产生少量的种子等。由此可见，COI1功能完全丧失会完全中断茉莉素信号传导，而COI1部分功能丧失也会影响茉莉素的信号传导。因此，在茉莉素信号传导途径中，COI1起着至关重要的作用，是必不可少的控制因子。

2 SCFCOI1复合体介导茉莉素信号传导

1998年Xie等[2]通过对分离的COI1基因所编码的氨基酸序列进行分析，发现COI1是一种F-box蛋白。在酵母和哺乳动物中，F-box蛋白能与Skp1和Cullin蛋白结合组装成SCF泛素蛋白连接酶复合体（Skp1-Cullin-F-box protein complex）。该复合体可以识别并泛素化某些底物蛋白，进而使这些底物蛋白通过26S蛋白酶体降解。因此，COI1的克隆首次暗示着泛素介导的蛋白降解途径参与茉莉素的信号传导。随后的研究证明了COI1作为F-box蛋白，能与拟南芥Cullin1蛋白和类似于Skp1的拟南芥ASK1或ASK2组装成SCFCOI1复合体，介导茉莉素的信号传导[3－5]。COI1完全突变体coi1-1丧失了茉莉素调控的所有反应，正是由于突变的COI1蛋白不能形成SCFCOI1复合体所导致。位于COI1蛋白F-box结构域的第22位氨基酸由谷氨酸突变为丙氨酸，也会破坏SCFCOI1复合体的形成，从而丧失了对茉莉素的反应[3]。与拟南芥COI1同源的大豆F-box蛋白GmCOI1也能与拟南芥的ASK1和Cullin1形成SCFCOI1复合体，介导茉莉素的信号传导[6]，说明F-box蛋白COI1是植物茉莉素信号传导中保守的成分。

3 JAZ蛋白是SCFCOI1复合体的一类底物蛋白

2007年，Thines和Chini等[7-8]分别发现含有12个成员的JAZ蛋白家族是茉莉素信号途径中的一类抑制蛋白。JAZ蛋白是SCFCOI1泛素连接酶复合体的一类直接底物。茉莉素信号分子可以诱导SCFCOI1复合体结合JAZ蛋白，使其泛素化并通过26S蛋白酶体降解，最终解除JAZ蛋白对茉莉素信号通路的抑制作用，引起下游茉莉素反应。

JAZ蛋白含有中央的27个氨基酸组成的ZIM结构域和C末端Jas结构域。ZIM结构域同时也介导JAZ蛋白与其共抑制因子NINJA的相互作用，从而共同抑制茉莉素信号通路[9]。Jas结构域介导JAZ蛋白对茉莉素信号通路正调控转录因子MYC2的直接抑制作用[7,10]。

JAZ家族成员众多，且有不同的转录本。例如JAZ10.4是JAZ10基因的一个转录本。JAZ10.4在活性茉莉素分子存在的情况下不能与COI1相互作用，但仍可抑制转录因子MYC2。JAZ10.4可以通过ZIM结构域与自己或其他JAZ蛋白形成同源或异源二聚体的形式拮抗茉莉素反应[11]。这种特殊转录本的存在很可能会抑制过度的茉莉素反应。其他JAZ家族成员也普遍存在相似的机制[12]，这使得茉莉素信号途径更为丰富。

4 COI1是茉莉素信号传导的受体

在JAZ蛋白被报道之后，很多实验结果都显示SCFCOI1-JAZ复合体是接收茉莉素信号并启动下游信号传导过程的感受复合体[13-14]。但至此还不清楚SCFCOI1-JAZ复合体中哪一个蛋白是茉莉素的受体。2009年4月，Roberto Solano实验室发现螯合异亮氨酸（Ile）的茉莉酸分子（+）-7-iso-JA-Ile是植物体内茉莉素的活性形式[15]，这为茉莉素受体的发现提供有利条件。

2009年，清华大学生命科学学院谢道昕教授实验室通过遗传学和分子生化的方法，证明了COI1是茉莉素的受体[16]。首先，通过与生长素受体TIR1的同源分析，建立了一个COI1的分子模型，并对其进行优化，得到一个高质量的结构模型，从而分析其作为受体的可行性。该实验室结合COI1的高质量分子结构模型，进一步通过一系列的生化和遗传实验证明了COI1与JA-Ile以及冠菌素的直接作用，最后得到了一个COI1为受体的茉莉素信号感应模型，即：JA-Ile与COI1结合模型。

5 COI1-JAZ共受体模型

2010年10月，Sheard等[17]研究发现，茉莉素的感受机制是受肌醇磷酸增强的COI1-JAZ共受体形式。COI1的晶体结构：总体构架类似于TIR1，有一个N端的三螺旋 F-box模体（接近ASK1），C端由18个串联的LRRs形成了马蹄形腔结构域。与TIR1类似，COI1 LRR结构域的上表面有三个内部重复的长环——loop-2,loop-12 and loop-14，这在激素与多肽底物的结合中起作用。与TIR1不同的是，在COI1 LRR结构域折叠的C端顶部序列存在第四个长环loop-c，它在loop-2的上方，部分地覆盖loop-2。尽管拥有相似的骨架结构，COI1形成了一个与TIR1完全不同的激素结合区域。以loop-2和LRR腔内表面之间结构为基础，COI1的配体结合口袋特有地被氨基酸侧链环绕。形成这一口袋的许多残基为大氨基酸且带有极性的头部。这一特性使得他们在近结合配体的某一化学组分时，可以使结合口袋形成一个特定的结构。这一近作用在酵母双杂交实验中，对正确的激素感知复合体是极其重要的，COI1蛋白这些侧链上的大氨基酸某一位点的突变足以打断COR存在条件下COI1-JAZ1的结合。在结合口袋，JA-Ile和COR均处于“向上”的位置，它们共有的环戊酮的酮基向上，与COI1口袋入口的Arg 496和Tyr 444形成了三角的氢键网络。在没有JAZ降解子肽链的结合，这一酮基部分是可以被溶解的。JA-Ile和COR环戊酮环的剩余部分夹在COI1上的芳香族成员Phe 89和Tyr 444之间，以疏水作用稳定。

COR上的环己烯环提供了一个平整的表面紧密地和Phe89联系，同时JA-Ile更具弹性和伸展的苯环侧链与loop2上的Ala 86,Phe 89和Leu 91和LRRs上的 Leu 469和Trp 519结合，这一联系更为松弛。这一不同或许可以解释结合实验中COR比（3R,7S）-JA-Ile几乎高出十倍。

激素结合口袋的深处，JA-Ile和COR的酰胺和羧基组分通过与COI1的三个氨基酸残基Arg 85,Arg 348和Arg 409，形成一个盐桥和氢键网络，结合在结合位点的底部。同时，那些精氨酸残基构成了激素口袋的带电平台。Tyr 386则通过与激素的氨基组分形成氢键从顶部加强作用。这样，Tyr386到达了配体的环戊酮环，缩小了口袋入口并使下方形成了一个疏水的腔。基部的剩余部分则由Val 411,Ala 384和Arg 409的脂肪侧链形成。而COR和JA-Ile的亮氨酸侧链得的乙基环丙烷组分的大小和疏水性使其二者很少地适合这一空间。这一腔的性质可以解释COI1对JA衍生物的选择性，即必须包含一个中度大小的疏水氨基酸。虽然这一配体的大部分结构包裹在结合区域内部，顶部的酮基和底部的羧基部分仍然暴露在外，这使得其可与共受体中的JAZ部分作用。

COI1的开放口袋高特异地识别活性激素形式（3R，7S）-JA-Ile，高亲和的激素结合需要一个双向的JAZ降解序列，在之前的研究中，JAZ蛋白与COI1蛋白的结合区域是位于C端的Jas模体，包含SLX2FX2KRX2RX5PY共同序列并在之前有两个连续的基本残基。为进一步定位Jas模体中与COI1高亲和配体结合这一微小区域，运用合成的JAZ1多肽片段进行配体结合实验，最终将由Glu 200-Val 220这一段短序列定义为JAZ1降解子（JAZ1 degron）。这一序列包括一个保守的α-螺旋以锚定在COI1上，还有一个环状区域以拦截激素使进入COI1的结合口袋。

此外，肌醇-5-磷酸作为第三种重要组分被发现，它与COI1和JAZ均互作，并接近激素所处位置。这一发现，高度体现了COI1蛋白作为F-box蛋白，起多分子信号中心的作用。

6 小 结

茉莉素受体COI1的分离和证明使人们对茉莉素感知及下游信号通路起始的分子机制有了更直接、深刻的认识。而同时，COI1与JAZ蛋白作为共受体形式共同感受茉莉素，这对于F-box蛋白的研究有了进一步的功能认识，丰富了植物激素与受体之间作用模式及激素信号传导的方式，具有重要意义。

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