20种市售凉茶类植物饮料抗氧化性的比较研究

何秋彤，余以刚*，李聪聪，李经桐，吴 晖

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)

20种市售凉茶类植物饮料抗氧化性的比较研究

何秋彤，余以刚*，李聪聪，李经桐，吴 晖

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)

利用DPPH自由基清除实验、ORAC法和Fe3+还原能力实验，考察20种市售凉茶类植物饮料的抗氧化性。结果表明：20种凉茶在不同的抗氧化评价体系中均表现出不同程度的抗氧化能力。运用模糊评价理论建立的抗氧化综合评价模型表明，抗氧化综合评价值最高的5种凉茶类植物饮料皆为传统凉茶铺出售的凉茶。各凉茶试样的抗氧化综合评价值与总酚含量有一定的相关性，但线性关系不显著。

抗氧化性；凉茶；总酚含量；黄酮含量；模糊综合评价

随着现代医学的迅速发展，现已证明自由基和活性氧对人体组织的损伤与多种疾病的发生密切相关[1-2]，如：炎症、肿瘤[3]、老年痴呆症[4]、动脉粥样硬化[5]等。抗氧化剂或自由基清除剂能有效抑制或缓解自由基和活性氧对机体的不利影响，起到防病、治病和延缓衰老的作用。近年来对中药大量的研究表明：中国传统中草药是很有潜力的天然抗氧化剂来源，其疗效与具有的抗氧化性能密切相关[6]。目前，国内外不少学者对各种中药提取物进行了抗氧化性研究，但他们大多只是对某单味中药的抗氧化性进行研究[7-9]。

凉茶是岭南人民根据本地的气候、水土特性，在长期预防疾病与保健的过程中以中医养生理论为指导，以多种中草药为基础，研制总结出的一类具有清热解毒、生津止渴等功效的饮料总称[10]。近来有研究指出广东凉茶能缓解小鼠细胞内的氧化应激状态从而达到“泻火”的功效[11]。本研究将对20种市售凉茶类植物饮料的体外抗氧化性和相关功效成分进行初步研究，为进一步解释凉茶“清热解毒、下火去湿”的功效和开发新型凉茶保健产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售20种凉茶类植物饮料，依次编号为1#～20#，生产日期皆在2010年3～4月间，其中1#～13#购于广州好当家超市，14#～16#和17#～20#分别购自广州两家知名的传统凉茶铺，储存于-20℃冰箱备用。

Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)、(+)-儿茶素、福林酚试剂(Folin-Ciocalteu reagent)、 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 美国Sigma公司；AAPH [2,2'-Azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride]、荧光素钠盐 日本和光纯药工业株式会社；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Wallace 1420 VICTOR3荧光免疫分析仪 新加坡Perkin Elmer公司；Alpha 1-2 LD真空冷冻干燥机 德国Christ公司；Eppendorf 5804R离心机 德国Eppendorf公司；UV-2550紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除能力的测定

参考Enayat等[12]的方法，略作修改。经过预实验，将凉茶样品稀释20倍，分别取1mL稀释液，加入5mL 0.005g/100mL DPPH甲醇溶液，立即混匀，30min后用溶剂作参比在517nm波长测定其吸光度。以500μmol/L Trolox溶液作为阳性对照，清除DPPH自由基能力按式

(1)计算。

式中：A0为1mL 蒸馏水+ 5mL DPPH甲醇溶液的吸光度；A1为1mL 样品稀释液+ 5mL DPPH甲醇溶液的吸光度；A2为1mL 样品稀释液+ 5mL甲醇的吸光度。

1.3.2 氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)分析

参考Huang等[13]的方法并加以改进。具体测定方法如下：将样品、Trolox和荧光素钠盐溶解于75mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。在96多微孔板中依次加入20μL稀释到合适倍数的样液或者不同浓度的Trolox标准溶液(6.25～50μmol/L)，空白对照孔加入磷酸盐缓冲溶液。然后用排枪每孔加入200μL 荧光素钠盐溶液(95.6nmol/L)。96多微孔板的四周边缘行加入磷酸盐缓冲溶液作为保护行，将微孔板放入Wallace 1420 VICTOR3荧光免疫分析仪中，用Wallace 1420 Manager软件设定程序，自动混匀，37℃预热20min。最后，用排枪迅速加入20μL AAPH(119.4 mmol/L，现配现用)，自动混匀，马上开始测定。 荧光强度值(激发波长485nm；吸收波长535nm)每2.5min记录一次，每次记录前自动振荡混匀8s，共测定35 个循环。荧光强度分别记录为f1, f2, f3,……f35。每次测试都做Trolox 标准曲线。根据公式统计各浓度样品的AUC值[13]：

AUC = (0.5×f1/f1+ f2/f1+f3/f1+ … + fi/f1+… f34/f1+ 0.5× f35/f1)×2.5

最终结果根据空白与样品所得荧光猝灭曲线下的面积差计算得出，表示为Trolox 当量(trolox equivalents，TE)，单位是μmol TE/L。

1.3.3 Fe3+还原能力测定

参照Zhao等[14]的方法，略作修改。经过预实验，将凉茶原液稀释20倍，分别取1mL稀释液，加入2.5mL磷酸缓冲液 (200mmol/L，pH6.6) 以及 2.5mL 1g/100mL铁氰化钾溶液，混匀。 50℃恒温水浴20min后加入 2.5mL 10g/100mL三氯乙酸溶液，3500r/min 离心10min。取2.5mL上清液，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1g/100mL三氯化铁溶液。静置10min后，在700nm波长处检测吸光度。吸光度越大，说明还原能力越强[8]。考虑到某些凉茶样品具有深浅不一的棕褐色，每个样品都做对应的空白背景值测定(即实验步骤中不加入铁氰化钾溶液，以蒸馏水替代)。以抗坏血酸(30～210μg/mL)作标准曲线，还原能力用抗坏血酸当量AAE (ascorbic acid equivalents，AAE)表示，单位为μg AAE/mL。

1.3.4 总酚含量的测定

总酚含量采用Folin-Ciocalteu法[15]测定。根据预实验，14～20号凉茶样品稀释10倍。取0.5mL凉茶样液于15mL具塞比色管中，加入0.5mL Folin-Ciocalteau试剂、2mL 蒸馏水，混匀反应6min后加入5.0mL Na2CO3溶液(70g/L)和4mL蒸馏水，室温放置90min后于760nm波长处检测吸光度，以没食子酸为标准物绘制标准曲线(25、50、75、100、125、150、175、200μg/mL)。重复3次，结果以没食子酸当量(gallic acid equivalents，GAE)表示，单位为μgGAE/mL。考虑到某些凉茶样品具有深浅不一的棕褐色，每个样品都做对应的空白背景值测定(即实验步骤中不加入Folin-Ciocalteau试剂，以蒸馏水替代)。

1.3.5 黄酮含量的测定

参考Enayat 等[12]的方法并加以改进。具体测定方法如下：在96多微孔板中依次加入35μL凉茶样液、140μL ddH2O、10.5μL 5g/100mLNaNO2溶液。放入Wallace 1420 VICTOR3荧光免疫分析仪中设定程序自动混匀，25℃放置5min。加入10.5μL 10g/100mL AlCl3溶液。6 min后，加入70μL 1 mol/L NaOH溶液和84μL ddH2O。置于免疫分析仪中490nm波长处检测吸光度。以(+)-儿茶素为标准物绘制标准曲线(20、40、 60、 80、100、120、140、160μg/mL)。重复3次，结果以(+)-儿茶素当量(catechin equivalents，CE)表示，单位为μg CE/ mL。考虑到某些凉茶样品具有深浅不一的棕褐色，每个样品都做对应的空白背景值测定(即实验步骤中不加入NaOH溶液，以蒸馏水替代)。

1.4 统计学分析

使用SAS 8.0软件对数据进行统计学分析，每组实验中每个凉茶样品平行测定3次，实验数据表示为平均值±标准差。显著性分析采用t检验法。

2 结果与分析

2.1 凉茶对DPPH自由基的清除率

由表1可知，20种凉茶对DPPH自由基均有不同程度的清除作用，其中20#(95.51±0.12)%、15#(92.08± 0.30 )%、19#(91.19±0.48)% 这3种凉茶对DPPH自由基的清除作用均超过90%，具有很强的抗氧化作用。另外，DPPH自由基清除率大于50%的凉茶样品还包括18#、11#、17#、14#。本研究中所有凉茶的DPPH自由基清除率皆高于阳性对照：500 μmol/L Trolox 溶液，清除率为(4.91±0.23)%。

2.2 ORAC 测定结果

ORAC方法，又称为抗氧化能力指数，目前作为国际抗氧化能力测定的新标准，是当今抗氧化研究领域中人们最关注的评价方法之一。ORAC 值越高，抗氧化能力就越强[13]。

由表1可知，20种凉茶样液的ORAC值变化很大，为2087.52～6315.24μmol TE/L。抗氧化能力指数最高的前5个凉茶样品依次为17#＞15#＞14#＞18#＞20#。17#与15#间的差异不显著(P＞ 0.05)，15#与其余3种凉茶的差异显著(P＜0.05)，14#、18#与20#三者间的差异不显著(P＞ 0.05)。

2.3 Fe3+还原能力

植物活性成分的还原能力可作为其潜在抗氧化能力的重要信号。具有还原能力的物质能够还原脂质过氧化过程中产生的中间体，从而表现其抗氧化作用[14]。本实验通过测定Fe3+还原能力来进一步衡量各种凉茶的抗氧化性。由表1可知，各个凉茶样液都具有一定的Fe3+还原能力，为21.12～355.41μg AAE/ mL。还原能力最高的是20#(355.41μg AAE/ mL，即2.02 μmol AAE/mL)，该凉茶的还原能力高于胡萝卜汁(1.89 μmol AAE/mL)[16]和绿茶(1.54μmol AAE/mL)[16]。其次是18#凉茶(203.57μg AAE/ mL，即1.16μmol AAE/mL)，其还原能力虽然低于绿茶但仍略高于红葡萄汁(1.14μmol AAE/mL)[16]。

2.4 凉茶样液的总酚含量及黄酮含量

图1 1#～13#凉茶总酚含量Fig.1 Total phenol contents in herbal tea products 1#-13#

植物酚类化合物是近年天然抗氧化剂研究的热点之一，其酚羟基结构对活性氧等自由基具有很强的清除能力，是构成中草药抗氧化功效的重要功能性成分。由图1可知，1#～13#凉茶液的总酚含量变化很大，为30.13～293.24μg GAE/mL。其中2#、11#、13#、3#、6#、9#等6种凉茶的总酚含量均高于100μg GAE/mL。14#～20#凉茶样液是由凉茶原液经10倍稀释后得到的，稀释后的凉茶总酚含量仍然很高，总酚含量大小顺序依次为18#(232.58±2.99)μg GAE/ mL＞20#(224.58±2.04) μg GAE/mL＞19#(151.69±2.04)μg GAE/ mL＞15#(148.58± 3.14)μg GAE/ mL＞17#(86.36±1.10)μg GAE/ mL＞16#(76.58±1.41)μg GAE/ mL＞14#(67.24±4.56)μg GAE/ mL。

表1 20种凉茶所含的中草药种类及抗氧化能力Table 1 Chinese herb varieties and antioxidant activities of twenty kinds of commercial herbal tea

图2 20种凉茶黄酮含量Fig.2 Flavonoid contents in twenty kinds of commercial herbal tea

由图2可知，与总酚含量的测定结果类似，20种凉茶的黄酮含量变化也很大。15#的黄酮含量最高，为(249.96±7.21)μg CE/mL，10#的黄酮含量最低，仅为(4.89±0.19)μg CE/ mL。

2.5 总抗氧化活性的综合模糊评价

利用DPPH自由基清除实验、ORAC法和Fe3+还原能力实验对20种市售凉茶类植物饮料的抗氧化性进行比较研究，由于不同的测定方法有不同的反应机理，同一凉茶样液在不同的测定体系中测到的抗氧化性各不相同。为了对20种市售凉茶类植物饮料抗氧化性进行系统的综合评价，本研究运用模糊评价理论建立多因素综合评价数学模型[17]，以期对所测凉茶的抗氧化活性作综合比较研究。

根据极值标准化公式Zij=(Xij-Xijmin)/(Xijmax-Xijmin)，将原始性状指标值无量纲化置于闭区间[0,1]上。其中，Xij为第i号凉茶，第j个抗氧化方法指标值，Xijmax、Xijmin分别为第i号凉茶，第j个抗氧化方法指标的最大值和最小值。抗氧化综合评价值Zi=∑Zij(i=1,2,…,20；j=1,2,3)，计算结果见表1。

抗氧化综合评价值最高的前10种凉茶样品依次为20#＞15#＞18#＞17#= 19#＞11#＞14#＞2#＞16#＞6#。其中的7种凉茶(14#～20#)皆是购自本地传统凉茶铺的凉茶(保质期3d)。由此推测，传统凉茶铺的凉茶比超市货架的凉茶类植物饮料具有更高的抗氧化性，这可能是因为两类凉茶的制作工艺和中草药用量有所不同。传统凉茶铺更为注重凉茶“清热解毒、下火去湿”的药用功效，中草药用量多，口味偏苦涩，而超市货架的凉茶类植物饮料则可能更强调良好的口味，因此中草药的添加量相对较少。超市货架的凉茶类植物饮料(保质期12个月)在长期放置的过程中抗氧化活性成分也可能有所损失。

2.6 20种凉茶的抗氧化综合评价值与总酚、黄酮含量的相关性

比较20种凉茶的总酚含量与其抗氧化综合评价值(Zi值)之间的相关性关系，结果如图3、4所示。

图3 1#～13#凉茶总酚含量与抗氧化综合评价值的相关性Fig.3 Correlation between total phenol content and antioxidant evaluation value of herbal tea products 1#-13#

图4 14#～20#凉茶稀释液总酚含量与抗氧化综合评价值的相关性Fig.4 Correlation between total phenol content and antioxidant evaluation values of herbal tea products 14#-20#

图5 20种凉茶黄酮含量与抗氧化综合评价值的相关性Fig.5 Correlation between flavonoid content and antioxidant evaluation values of twenty kinds of commercial herbal tea

1#～13#凉茶的总酚含量与抗氧化综合评价值之间的线性关系方程式为y = 0.0042x + 0.0188，相关系数是0.6627(图3)，14#～20#凉茶稀释液的总酚含量与抗氧化综合评价值之间的线性关系方程式为y = 0.0071x + 0.8853，相关系数是0.6051(图4)，表明20种凉茶的抗氧化性都与总酚含量有一定的相关性，但线形关系不显著。同时，分析20种凉茶抗氧化综合评价值与黄酮含量的关系，结果表明二者的相关性较低(y = 0.009x + 0.4820，R2=0.3922)(图5)，进一步表明本实验测定的20种凉茶的抗氧化性主要成分不仅是多酚类物质，还存在其他具有抗氧化作用的物质(如多糖、类萜等)。

另一方面，采用Folin-Ciocalteu比色法测定的总酚含量是一个相对值，不同的酚类具有不同的结构和量效关系，从而具有不同的抗氧化作用[18]。再者，大部分凉茶配方是根据中医理论由多种中草药复合配伍而成，并非单味中草药，而不同的中草药具有不同的化学成分以及它们之间可能存在的相互协同作用，故不同的凉茶配方具有不同的抗氧化作用。从表1也可以发现，即使是选用相同中草药煎制的凉茶，也可能由于煎制工艺和中药添加量的差异而表现出不同的抗氧化效果。

3 结 论

利用DPPH自由基清除实验、ORAC法和Fe3+还原能力实验考察了20种市售凉茶类植物饮料的抗氧化性，结果表明20种凉茶均表现出了不同程度的抗氧化能力。运用模糊评价理论建立的抗氧化综合评价模型表明，5种传统凉茶铺出售的凉茶比超市出售的凉茶类植物饮料具有更高的抗氧化活性，这可能是因为两类凉茶的制作工艺和中草药用量有所不同。

另外，比较各凉茶试样的总酚含量与其抗氧化能力之间的相关性发现，1#～13#凉茶的总酚含量与抗氧化综合评价值之间的相关系数是0.6627，14#～20#凉茶稀释液的总酚含量与抗氧化综合评价值之间的相关系数是0.6051，相关性不明显，这一方面可能是与多酚种类以及含有其他抗氧化活性类物质有关，另一方面是由于不同凉茶配方使用不同的中草药种类、用量以及中草药之间可能存在相互协同作用。

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Comparison of Antioxidant Activities of Twenty Kinds of Commercial Herbal Tea

HE Qiu-tong，YU Yi-gang*，LI Cong-cong，LI Jing-tong，WU Hui
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Twenty kinds of herbal tea purchased from the local market were assessed for their antioxidant activities including DPPH radical scavenging activity, oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and Fe3+reducing power. Results indicated that all 20 kinds of herbal tea had antioxidant capacities in different antioxidant evaluation systems. In addition, a fuzzy comprehensive evaluation model was established to evaluate their comprehensive antioxidant capacity and five kinds of herbal tea with the highest comprehensive antioxidant capacity were all from two locally famous traditional herbal tea shops. A non-linear correlation between total phenol content and comprehensive antioxidant capacity of twenty kinds of herbal tea was achieved.

antioxidant activity；herbal tea；total phenol content；flavonoid content；fuzzy comprehensive evaluation

TS275.2

A

1002-6630(2011)07-0047-05

2010-06-11

2009年度广东省自然科学基金项目(9151064101000070)；2010年广东省大学生创新实验项目(S1010561066)

何秋彤(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。E-mail：Heqiutong430@163.com

*通信作者：余以刚(1968—)，男，副教授，博士，研究方向为食品质量与安全。E-mail：yuyigang@scut.edu.cn