高浓度氧对猪肺动脉内皮细胞钙离子浓度的影响

黄文峰 廖贵华 (三峡大学医学院,湖北 宜昌 443002)

以静脉途径给予高氧液是比较理想的氧疗方式,但仍有可能引起氧中毒,损伤细胞对象不确定且机制不明〔1〕。血管内皮与临床疾病密切相关,既是心血管疾病的病变基础,又是影响血管内皮相关疾病如肿瘤、感染进程的重要因素。内皮细胞能感受血流压力变化、炎性信号及血液循环中激素水平的变化,并通过胞内一系列信号分子如钙离子,调节血管舒缩状态,维持血管内外平衡〔2〕。与低氧刺激不同,关于高氧刺激对机体细胞内钙离子浓度影响的报道不多,Corinna通过原位观察发现〔3〕,离体大鼠肺在高氧刺激下,血管内皮细胞钙离子浓度可以升高。本实验首次以原代培养的猪肺动脉内皮细胞为研究对象,通过模拟高氧气体的刺激观察钙离子的变化情况。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 M199细胞培养基(Gibco,美国),小牛血清(Hycolone,美国),胰蛋白酶(Amresco,美国),Fura-2(Sigma,美国),双波长荧光分光光度计(850型,日本岛津公司)。

1.2 原代培养猪肺动脉内皮细胞 成年杂种猪,放血处死后取出心肺,无菌条件下剪开心包膜,分离肺动脉主干及其分支。用止血钳夹住两端,松开肺动脉主干端,用 D-Hank′s液灌洗肺动脉内腔直至洗出液清亮为止,加入 37℃预温的 0.25%的胰蛋白酶溶液 2～3ml,开始计时,夹闭管口,置 37℃温箱中孵育5～6 min。吸出消化液入一试管中,用含 10%小牛血清的M199培养基中和,用 M199培养基反复灌洗肺动脉腔,收集灌洗液,连同消化液一起以 1 000 r/min离心 10min,弃上清,沉淀用含 10%胎牛血清的 M199培养基重悬,吹打成细胞悬液。5～7 d后,细胞长满培养面,倒置显微镜下可见细胞呈鹅卵石样单层贴壁生长。用 0.25%胰蛋白酶按 1∶2传代培养。第 2～3代的细胞用于实验。

1.3 高浓度氧刺激方法及实验分组 流量为 5 L/min的高氧气体(5%CO2和 95%O2)在细胞培养瓶中平衡 2～5 min左右,使氧分压达到 250 mmHg和 550mmHg左右,然后瓶口被密闭,于 CO2培养箱中继续培养 0.5、1、2、4 h,然后分别测定钙离子浓度。

1.4 细胞内钙离子浓度的测定 测定前先用 0.125%胰蛋白酶消化大约 1 min,用适量的生长培养液终止胰酶的消化反应,并制备成浓度为 105个/ml的细胞悬液。取细胞悬液 1 ml,加入 0.5 mmol/L的Fura-2/乙酰酸甲酯(AM)(Sigma,USA)的二甲基亚砜(DMSO)贮备液 4μl(终浓度 2μmol/L)负载。置37℃、5%CO2培养箱孵育 40 min后,1 500 r/min离心 5 min,小心吸出上述负载液,避免细胞团块倒出。然后用含 0.2%牛血清白蛋白的 D-Hanks液洗涤细胞 2次,每次洗涤均以1 500 r/min离心后小心吸出液体,防止细胞丢失。最终用 3 ml含钙离子 D-Hanks测定液〔mmol/L:NaCl 140.000;KCl 4.765;CaCl215.652;葡萄糖(Glucose)53.763;3-环乙氨基丙磺酸(HEPES)5.000;pH7.0～7.2〕悬起细胞。双波长荧光分光光度计测定钙离子的条件为狭缝宽度 10 nm,以 340 nm和 380 nm波长激发,500 nm波长发射,根据下式计算细胞内游离钙含量:

Kd=224 nmol/L;R=F340/F380;Rmax为 Fura-2饱和时产生的最大荧光比值,以 1%Triton X-100(1 ml细胞悬液加 10%Triton X-100 100μl)测定;R min为 Fura-2游离时形成的最小荧光比值,以 50 mmol/L EGTA〔1 ml细胞悬液加 500 mmol/L乙二醇双四乙酸(EGTA)100μl〕测定。每个波长各测定 2次荧光值(F),取其平均值。FD、FS分别代表 Ca2+为零和饱和状态下,在 380 nm波长测得的荧光值。

1.5 统计学分析 用 SPSS13.0统计软件进行分析,数据以±s表示,多组间样本均数的比较用 F检验。

2 结 果

2.1 高氧对猪肺动脉内皮细胞生长的影响 经高氧刺激后,猪肺动脉内皮细胞在形态上出现折光性减弱、细胞皱缩等生长不良的特征,培养基的p H值变化不明显。

2.2 高氧对猪肺动脉内皮细胞胞内钙离子浓度的影响 当培养液氧分压达到 250 mmHg时,与常氧对照组相比,钙离子浓度开始变化并不明显,在1h时可以观察到明显升高(P＜0.05);当培养液氧分压达到 550mmHg时,与常氧对照组相比,钙离子浓度在 0.5h时可以观察到增高(P＜0.05),1h时升高更为显著;对于相同刺激时间点,氧分压越高,钙离子浓度也越高。见表 1。

表1 高氧对猪肺动脉内皮细胞胞内钙离子浓度的影响(±s,n=5,μmol/L)

表1 高氧对猪肺动脉内皮细胞胞内钙离子浓度的影响(±s,n=5,μmol/L)

与常氧对照组比较:1)P＜0.05

培养液氧分压 常氧对照组 0 h 0.5 h 1 h 250 mmHg组 110.85±32.33 107.15±55.16 113.62±26.35 125.23±31.381)550 mmHg组 110.85±32.33 116.76±33.58 126.81±10.691) 137.37±29.621)

3 讨 论

血管内皮细胞是血流和血管壁组织之间的物理屏障,对维持血流状态、血管内外物质交换起重要作用;血管内皮细胞具有活跃的内分泌功能,在创伤修复、血管生成、血栓形成、血压稳定等方面发挥着重要的调节功能。由于血管内皮细胞和血液直接接触,容易受到血液中各种因素的影响,导致内皮细胞功能障碍,从而成为许多疾病发生的重要环节〔2〕。

氧疗对于心脑血管疾病有着较好的辅助治疗作用,可以提高动脉血氧分压和动脉血氧饱和度,增加动脉血氧含量,纠正各种原因造成的缺氧状态,促进组织新陈代谢。静脉给氧技术是非常有希望的氧疗方法,能有效的治疗各种缺血缺氧性疾病,且相对安全,不良反应少〔4〕。钙离子是机体的必需元素,也是机体的第二信使,广泛参与细胞内多条途径的信号传递,从而影响细胞的多种生理活动,对维持细胞各种代谢过程非常重要〔5〕。有关高氧时对细胞信号转导系统影响的报道很少,使得人们对于在高氧条件下如何进一步增强细胞利用氧的能力和防止氧中毒等带来认识上的不足。已知高氧刺激细胞时,活性氧生成增多,其他信号分子如核转录因子(NF-κB),一氧化氮(NO)也会发生相应变化〔6〕,但钙离子的变化情况尚不清楚。Corinna模拟机械通气的方法,原位观察离体大鼠肺内皮细胞相关信号分子的变化,发现活性氧和钙离子在高氧时均增高〔3〕。也有学者研究肺泡巨噬细胞发现,经高氧刺激后钙离子升高,可能与其吞噬功能变化有关〔7〕。

本研究结果表明,原代培养的猪肺动脉内皮细胞在不同氧分压的高氧刺激下可以导致胞内钙离子升高,当氧分压不太高时,钙离子浓度并不立即升高,表明内皮细胞对高氧有一定的耐受性;随着氧分压的增高,钙离子浓度也相应升高;相同时间点比较,氧分压引起钙离子浓度升高的效应也很明显。氧分压引起猪肺动脉内皮细胞钙离子浓度升高的机制可能与细胞自我保护有关,引起内质网和线粒体释放钙离子。

1 潘 丽,富建华,薛辛东.氧化/抗氧化失衡与高氧肺损伤〔J〕.中国当代儿科杂志,2009;11(3):237-9.

2 陶 军.高血压与血管内皮功能〔J〕.中国实用内科杂志,2009;29(9):783-6.

3 Brueckl C,Kaestle S,Kerem A,et al.Hyperoxia-induced reactive oxygen species formation in pulmonary capillary endothelial cells in situ〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol,2006;34(4):453-63.

4 曹俊华,李健和,彭六保,等.高渗高氧静脉制剂的应用机制〔J〕.中国新药与临床杂志,2009;28(8):566-70.

5 丁 烨,王 枫 .膳食钙对高血压的降压机制研究进展〔J〕.国外医学.卫生学分册,2006;33(6):369-72.

6 Thom SR,Bhopale V,Fisher D,et al.Stimulation of nitric oxide synthase in cerebral cortex due to elevated partial pressures of oxygen:an oxidative stressresponse〔J〕.J Neurobiol,2002;51(2):85-100.

7 Wesselius LJ,Williams WL,Bailey K,et al.Iron uptake promotes hyperoxic injury to alveolar macrophages〔J〕.Am J Respir Crit Care Med,1999;159(1):100-6.