EGb761对慢性脑缺血老龄大鼠学习能力及脑少突胶质细胞表达的影响

王金兰 仲玉洁 (郑州大学第二附属医院神经内科,河南 郑州 45004)

中枢神经系统髓鞘由少突胶质细胞(OLG)形成〔1〕,髓鞘是神经信号跳跃式传导的物质基础。研究发现慢性脑缺血容易导致脑白质脱髓鞘,且这种变化与少突胶质细胞损害密切相关〔2,3〕。髓鞘脱失,神经传导受到严重影响,导致机体学习认知功能障碍。标准银杏叶提取物(EGb761,Ginkgo biloba extract 761)在治疗学习认知功能障碍方面得到了肯定,但其相关作用机制的研究相对较 少。 2′3′-环核 苷酸 3′-磷 酸二酯酶(2′3′-cyclic nucleotide3′-Phosphode-esterase,CNPase)是一 种髓鞘标志酶,而且在 OLG中含有高水平 CNPase。本试验通过对慢性脑缺血大鼠模型给予 EGb761进行干预,应用 CNPase抗体标记成熟OLG并观察其表达情况,探讨EGb761对老龄大鼠学习能力及脑OLG的影响,为其在认知功能治疗机制方面开辟新思路、提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 30只雄性 12月龄 SD大鼠,体重(400±30)g,由郑州科大学医学院实验动物中心提供。随机分成三组:假手术组,单纯缺血组,EGb761干预组,每组 10只。

1.2 主要试剂与仪器 EGb761(达纳康,按国际标准银杏叶提取物要求选取,内含 24%的银杏黄酮苷和 6%的萜烯内酯),40 mg/粒,由法国博福-益普生制药工业公司生产;MG-2C/3C迷宫刺激器,由张家港市生物医学仪器厂生产;CNPase抗体(2′3′-环核苷酸 3′-磷酸二酯酶抗体),购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 慢性脑缺血模型鼠的制作 参考 Wakita等〔4〕方法制备动物模型。10%水合氯醛(0.3 mg/100 g)腹腔内注射麻醉后,颈部备皮、消毒,颈正中切开皮肤,切口约 1.5～2.0 cm,钝性分离筋膜、胸骨舌骨肌,分离出双侧颈总动脉,每侧用双线分别在近心端和远心端结扎,然后在两结扎处之间剪断颈总动脉制备出单纯缺血组和干预组模型,假手术组仅分离双侧颈总动脉而不结扎,缝合切口,对皮并消毒,放回原环境中饲养。

1.4 给药方法 将达纳康研成粉末状,用蒸馏水溶解并混匀,术后 24h按照 0.5 ml/100g予灌胃,单纯缺血组给予等量蒸馏水灌胃,各组灌胃均为每日一次,持续 12 w。

1.5 学习能力测试 大鼠的学习能力测试在呈三等分辐射状的 Y迷宫中进行,环境为安静暗室。Y迷宫每臂顶端各装一盏15 w的刺激信号灯,相应臂的信号灯亮时,该臂不通电为安全区,另外无灯光的两臂及交界区均通以 50～70 V交流电而成为电击区。实验开始时,让大鼠在起步区(大鼠开始所在的臂)适应 5 min,然后无规则次序变换安全区,观察动物学会逃离电击区而进入安全区的反应能力。规定大鼠在受电击后10s内一次性跑向安全区为正确反应。实验中每次通电刺激的间隔时间为 30s。以大鼠连续训练 10次中出现 9次以上正确反应作为学会的标准,以达到学会标准所需总电击次数表示学习成绩。

1.6 标本的收集与处理 大鼠经麻醉后,常规生理盐水及多聚甲醛灌注、固定,断头取脑,制作脑部冠状石蜡切片(厚度4μm),采用免疫组化染色,检测脑皮层、胼胝体及海马 CNPase阳性细胞数的情况。

1.7 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件进行分析,应用独立样本 t检验。

2 结 果

2.1 大鼠学习成绩测试结果 大鼠学习成绩测试结果显示,假手术组大鼠反应良好,学习成绩为(33.3±1.16);而单纯缺血组大鼠表现反应迟钝,达标所需训练次数明显增多,成绩为(68.3±2.06),与假手术组相比差异显著(P＜0.01);EGb761干预组的学习成绩(46.9±1.45)明显好于单纯缺血组,差异具有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 大鼠脑 OLG CNPase的变化情况 各组均取皮层、胼胝体、海马处进行观察并统计 CNPase阳性细胞个数。单纯缺血组 CNPase阳性细胞数明显少于假手术组和 EGb761组,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。见表 1。

表1 大鼠皮层、胼胝体、海马 CNPase阳性细胞表达情况(±s,n=10,个/400倍高倍镜视野)

表1 大鼠皮层、胼胝体、海马 CNPase阳性细胞表达情况(±s,n=10,个/400倍高倍镜视野)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与单纯缺血组比较:2)P＜0.01

组别 皮层 胼胝体 海马假手术组 9.7±1.34 27.8±1.93 7.7±0.95单纯缺血组 4.8±1.031) 18.2±1.751) 3.9±0.881)干预组 7.1±1.12) 23.8±1.322) 5.7±0.822)

3 讨 论

既往人们认为脑白质对缺血具有很高的耐受性,这一观点影响着对缺血后胶质细胞改变及机制的研究,近年发现 OLG对缺血高度敏感〔5～7〕,影像学研究显示老年人脑白质改变非常常见,认为与血管病变导致的慢性、持续性缺血有关,而当慢性脑缺血时 OLG较神经元更易受损。此外,与神经元不同,胶质细胞损害后具有较强的再生能力,已经发现在室管膜周围存在OLG前体细胞,在一定条件下它可以增殖、分化并迁移至损伤区域〔5〕,起修复的作用。所以,以白质损害为主的病变具有较好的恢复潜力和更高的治疗价值,保护 OLG损害也对预防老年性白质改变及相关的认知功能降低具有重要价值〔2〕。

本文提示慢性脑缺血可造成学习认知能力障碍。采用免疫组化 CNPase标记OLG的方法观察大鼠脑组织中 OLG的表达情况,结果显示,单纯缺血组大鼠皮层、胼胝体、海马内的CNPase表达较假手术组显著减少,提示OLG存在缺血易损性。

国际标准 EGb761,含 24%的银杏黄酮苷和 6%的萜烯内酯等多种活性物质,其药理作用较广泛,可协同作用于有关氧化应激、血液循环、神经递质和炎症反应等不同的病理过程,是针对提高人的认知功能应用最广泛的草药制剂,在欧洲尤其盛行,德国官方批准EGb761用于治疗阿尔兹海默氏症。本实验结果显示,EGb761提高模型大鼠定向学习记忆能力,其可能机制是通过抑制 OLG对缺血性损伤高度敏感的相关机制,包括氧化应激、兴奋性氨基酸和凋亡通路激活等〔7〕,减轻 OLG在慢性脑缺血时的损伤、促进其再生及修复,减少髓鞘的脱失,从而改善神经信号传导,改善学习认知功能障碍。

1 王新德,魏岗之.神经病学:神经系统脱髓鞘性疾病〔M〕.北京:人民军医出版社,2003:1-238.

2 李昕华,徐忠信,王晓明,等.慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠神经细胞 Caspase-3表达及 GDNF给药的影响〔J〕.中国生物制品学杂志,2008;21(3):224-6.

3 Onteniente B,Rasika S,Benchoua A,et al.Molecular pathways in cerebral ischemia:cues to novel therapeutic strategies〔J〕.Mol Neurobiol,2003;27(1):33-72.

4 Wakita H,Tominoto H,Akigauthi I,et al.Glia activation and white matter changes in the rat brain induced by chronic cerebral hypoperfusion:an immunohistochemical study〔J〕.Acta Neuropathol,1994;87(5):484-92.

5 王丽娟,徐 超.定量评估大鼠局灶性脑缺血再灌注后少突胶质细胞的病理学变化〔J〕.临床神经病学杂志,2010;23(1):28-30.

6 杨 晶,邓 方,乔 松,等.慢性脑缺血对大鼠神经行为学和脑白质病理学变化的影响〔J〕.中国脑血管病杂志,2009;6(12):646-50.

7 Dewar D,Underhill SM,Goldberg MP.Oligodendrocytes and ischemic brain injury〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2003;23(3):263-74.