半胱氨酸蛋白酶-8在大鼠小肠缺血再灌注后 TNF-α诱导肺损伤中的作用

陈玉强 房学东 王跃生 孟凡石 (吉林大学第二医院,吉林 长春 3004)

缺血再灌注(I/R)损伤是在缺血的基础上恢复血流后,组织器官的损伤反而加重的现象,是外科常见的一种损伤。由于小肠为体内最大的细菌库和淋巴库,小肠I/R除了会引起局部组织的损伤外,更会由于细菌和毒素的释放,移位到体循环而引起网状内皮系统发生系列反应,发生急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和多器官功能障碍综合征(MODS),是患者死亡的主要原因之一〔1〕。但是,细胞炎性介质释放的增加和细胞凋亡的产生以及脏器损害的发生机制,至今为止还不清楚。本文拟通过探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导细胞凋亡的同时以及半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)表达的研究,对小肠缺血所引起的远隔脏器损害的发生机制进行分析,探寻一种全新的预防和治疗肠系膜血管缺血性疾病导致ARDS和MODS的方法。

1 材料与方法

1.1 材料 Caspase-8(1∶100)购自上海沪尚生物科技有限公司;TNF-α购自武汉博士德生物工程有限公司;Ultra SensitiveTM S-P超敏试剂盒(鼠/兔)和 DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 方法 健康雄性 Wistar大鼠 48只,清洁级,2～3月龄,体重 200～250 g,吉林大学实验动物中心提供。随机分为正常组、假手术组、对照组和实验组。10%水合氯醛腹腔注射(0.25 ml/100 g体重),麻醉满意后,取仰卧位固定。腹部常规消毒后无菌条件下取腹正中切口约 3～4 cm入腹,将肠管推向左侧,游离肠系膜上动脉,以无创伤动脉夹夹闭肠系膜上动脉起始部,缝合切口〔2〕。60min后经原切口进腹,取出动脉夹,恢复血供。再灌注结束后,实验组动物给予腹腔注射 TNF-α(1.5 mg/100 g体重),对照组不给予腹腔注射 TNF-α,假手术组不予阻断肠系膜上动脉。24 h后,所有大鼠脱颈处死,剪开胸腔,充分暴露肺脏,左肺进行灌注固定,右肺立即取部分肺组织称湿重(W)并记录,而后置于 80℃烘箱烘干 48 h至恒重,称干重(D),求得湿干比值(W/D)。左肺置于 10%甲醛中 4℃下固定 24 h后,酒精梯度脱水、二甲苯透明,石蜡包埋,切片,厚度2μm。采用链霉素菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP)免疫组织化学染色,按试剂盒操作说明进行,DAB显色,苏木素复染。在低倍镜(40倍)下选取阳性表达密集区,在高倍镜(400倍)下观察细胞形态、染色定位和程度。每组选取 6张切片,每张切片随机选取 5个不同重叠视野,输入计算机分析累积光密度值。

2 结 果

2.1 肺组织 W/D值的变化 实验组肺组织的 W/D值(6.58±0.05)显著高于正常组(3.18±0.03)、假手术组(3.21±0.02)和对照组(4.25±0.04)(均 P＜0.05);对照组肺组织 W/D较假手术组和正常组明显升高(P＜0.05)。

图1 各组大鼠肺组织中 caspase-8免疫组织化学染色(×400)

2.2 肺组织 caspase-8的检测 与对照组比较,实验组caspase-8表达增强,主要分布在肺泡上皮细胞的胞浆,棕黄色,细颗粒状,见图 1。实验组 caspase-8累积光密度值(2 048.01±118.33)较对照组(1 201.08±85.34)差异显著(P＜0.05);对照组较假手术组(451.21±57.63)和正常组(416.32±71.69)明显升高(P＜0.05)。

3 讨 论

小肠 I/R后的病理生理机制尚不清楚,学者们先后提出了一系列学说。由于毒素及各种细胞因子的释放,通过血液循环,远隔脏器受到损害,其中增加的 TNF-α是导致肺脏损害的主要因子之一,并且可以诱导肺上皮细胞的凋亡〔3〕。急性肺炎症反应与细胞因子表达和导致细胞凋亡的信号级联放大系统有关。这个级联放大系统是通过 TNF-α激活的,TNF-α是调节必要生物学功能的细胞因子家族典型成员,对于外界压力和刺激具有反应〔4〕。它最初是通过免疫细胞,如单核和巨噬细胞释放的,其他类型的细胞,包括腺泡细胞也能释放。TNF-α与两种细胞膜受体结合,即 TNF-α受体 1(TNFR1)和 TNF-α受体 2(TNFR2)。尽管多数细胞系和组织均表达两种亚型,TNF-α的生物学活性主要通过 TNFR1调节。

靶细胞暴露到 TNF-α后,可能通过关闭自身受体下调它们对于细胞因子的反应。为了结合循环中过量的 TNF-α,就要释放可溶性的抗体,因此两种可溶性受体(TNFR1和 TNFR2)比TNF-α具有更长的半衰期,它们的浓度能够反应 TNF-α的活性〔5〕。TNF-α在炎症过程中的始发作用已经通过几个细胞系、动物模型和人体实验得到验证〔6～8〕。在炎症反应中,过量的TNF-α在炎症基因诱导、细胞死亡、内皮细胞的增加、免疫细胞的聚集和活化过程中具有关键作用〔9〕。

肺组织 W/D是目前常用的评价肺水肿和反映微血管损伤的指标,肺组织损伤后,微血管内皮细胞和肺泡上皮细胞间隙增大,导致肺泡腔内大量炎性物质渗出、集聚、出血及炎性细胞游走。因此,肺损伤后 W/D升高,而实验组 W/D值显著高于正常组、假手术组和对照组,证明实验组大鼠肺损伤较重。

在凋亡的信号通路中,caspase-8作为凋亡受体诱导的第一个放大信号,在细胞凋亡过程中受到广泛研究。Caspase-8是包含 480个氨基酸分子量为 55 kD的蛋白,在它的N端前结构域包括 2个死亡效应域(DED),在它的C端是一个蛋白酶催化剂结构域。DED结构的功能为蛋白之间相互作用提供平台〔10〕。在蛋白水解反应中,活化的caspase-8分子是由 2个大的和 2个小的亚基构成的四聚体〔11〕。在失活状态下,在大多数细胞中caspase-8是作为最开始半胱氨酸蛋白酶的酶原形式出现。凋亡发生后,通过激活的死亡受体,caspase-8通过聚合成聚合体成为活化状态〔12〕。

在哺乳动物细胞中,主要存在两种细胞凋亡途径,即细胞外(受体)途径和细胞内(线粒体)途径〔13〕。无论是细胞外还是细胞内途径的刺激都能导致半胱氨酸蛋白酶活化。半胱氨酸蛋白酶在进化过程中是高度保守的家族,是细胞死亡各种形式常见的有效分子。一旦活化以后,它们切割胞浆或者胞核中的各种底物,导致细胞凋亡〔11〕。在细胞外凋亡途径中,TNF死亡受体的刺激导致 caspase-8活化,随后直接切割下游有效半胱氨酸蛋白酶,如 caspase-3〔14〕。同时,活化的 caspase-8可能通过切割 Bid,连接受体到线粒体途径。而 Bid是 Bcl-2家族蛋白,在切割后能产生 BH 3结构域定位到线粒体,通过线粒体放大系统扩大〔15〕。在线粒体途径中,各种凋亡因子的释放最终激活了 caspase-3〔16〕。而 caspase-3是该途径的最后值行者,具有“杀手蛋白”之称。

本研究表明 caspase-8活化后参与到小肠 I/R后 TNF-α诱导的肺损伤中,是TNF-α细胞信号通路中的重要一部分组成。抑制其表达活性,可能减轻肠系膜血管缺血性疾病导致的ARDS和 MODS。

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