分泌型磷脂酶 A2对脐静脉内皮细胞分泌和表达 MCP-1、ICAM-1的影响

王玲香 郭拥军 赵 岩 谢 强 李卫华

(福建医科大学附属厦门第一医院心血管内科,福建 厦门 361003)

动脉粥样硬化(AS)是世界上危害中老年患者健康的主要疾病,目前得到广泛认可的发病机制是“炎症诱导的内皮损伤学说”〔1〕,它的核心在于一些炎性因子,如肿瘤坏死因子、单核细胞趋化因子(MCP-1)、细胞间黏附分子(ICAM-1)能够造成血管内皮细胞损伤,引发单核细胞迁移形成泡沫细胞,平滑肌细胞增殖,促进脂质条纹变成纤维斑块等一系列反应,导致 AS的发生。近年来的研究发现,分泌型磷脂酶A2(sPLA2)参与AS的发生发展过程。sPLA2最初是从类风湿关节炎患者的滑膜液和血小板中分离和提纯出来,并在一些严重的炎症如败血症、感染性休克中亦发现有此类酶存在,且酶的浓度和疾病严重程度呈正相关〔2〕。国外研究表明,在 AS的形成和斑块破裂过程中,sPLA2分泌明显增高〔3〕。国内研究中,冠心病患者sPLA2浓度明显升高,在一定程度上可反映出冠心病的炎症状态〔4〕。本实验通过体外培养脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),观察 sPLA2对其表达 MCP-1和 ICAM-1水平的影响,以探讨sPLA2在 AS过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂 HUVEC购自Cascade公司,M200培养基、内皮生长因子合剂(含有 bEGF、VEGF、氢化可的松和肝素等)均购自 Cascade公司,L-谷氨酰胺、胰蛋白酶、青链霉素均购自 Sigma公司,小牛血清(FBS)购自 PAA公司,磷脂酶 A2购自 Sigma公司,MCP-1和 ICAM-1的 ELISA试剂盒均购自武汉博士德生物有限公司,cDNA合成试剂盒,RT-PCR试剂盒及引物合成均购自大连宝生物有限公司。

1.2 细胞培养 HUVEC培养于含有 2%的 FBS、内皮生长因子合剂的 M200培养基中,置于 37℃,5%CO2培养箱中培养,当细胞生长融合 80%时传代,每周传代 2次。取第 4～6代的细胞,铺入 24孔板内,置入培养箱中,生长融合至 60%时按实验组加入不同浓度的磷脂酶A2。

1.3 实验分组 共分为 6组:空白对照组,磷脂酶A2干预组(按终浓度为 10-3,10-2,10-1,1,10 U/ml分为 5组),加入各种浓度的酶后孵育 24h,分别收集细胞和培养基上清。

1.4 ELISA 采用双抗体夹 ELISA法检测细胞培养基上清液中 MCP-1和 ICAM-1的含量。每组设 5个复孔,按照拟合标准曲线计算出待测样品中MCP-1和ICAM-1的含量。

1.5 PCR方法检测 MCP-1和ICAM-1 mRNA的表达水平 分别收集培养的各组细胞,按RNA提取试剂盒说明书提取细胞的总 RNA。逆转录合成 cDNA:在无 RNase的新PCR管中依次加入:5×Primescript buffer 2.0μl,oligo DT Primer 0.5μl,Rardom 6mers 0.5μl,RNA与 ddH2O共 6.5μl,共 10μl体系。逆转录反应条件:37℃变性 15 min,85℃ 5 s。PCR引物设计:MCP-1、ICAM-1和 GAPDH引物序列见表 1。在 PCR管中依次加入下列试剂,共 10μl:SYBR 5μl,上游引物和下游引物均0.4μl,cDNA 1μl,dd H2O 3.2μl,混匀后短暂离心。置 PCR仪器中,按以下条件进行 PCR反应:反应条件为:95℃预变性15 s;94℃ 5s,58℃ 15 s,72℃ 15s 40个循环。

表1 RT PCR引物序列及扩增子大小

1.6 统计学处理 使用 SPSS 13.0统计软件对进行分析,数据以±s表示,组间比较采用t检验和直线相关分析。

2 结 果

2.1 sPLA2刺激 HUVEC后 MCP-1和 ICAM-1蛋白表达的影响与对照组相比,不同浓度的 sPLA2刺激 HUVEC后 MCP-1和ICAM-1蛋白表达水平均增加(如图 1),且随着 sPLA2的浓度越高,MCP-1和ICAM-1蛋白表达水平越高,具有直线相关性。其中,MCP-1蛋白水平和 sPLA2的浓度的直线相关系数为 0.78,呈显著相关(P＜0.05);ICAM-1蛋白表达水平和 sPLA2的浓度直线相关系数为 0.84,呈高度相关(P＜0.05)。当 sPLA2的浓度为10 U/ml时,MCP-1蛋白水平较空白对照组增加 2.19倍,ICAM-1蛋白水平较空白对照组增加 1.64倍。见图 1。

图1 不同浓度 sPLA 2刺激 HUVEC后分泌的MCP-1和 ICAM-1蛋白表达水平的变化

2.2 sPLA2刺激 HUVEC后 MCP-1 ICAM-1的 mRNA表达的影响 与对照组相比,不同浓度的 sPLA2刺激 HUVEC后MCP-1和 ICAM-1的 mRNA表达水平均增加,且随着 sPLA2的浓度越高,MCP-1和 ICAM-1的 mRNA表达水平越高,具有直线相关性。其中,MCP-1的mRNA水平和sPLA2的浓度的直线相关系数为 0.91,呈高度相关(P＜0.05);ICAM-1的 mRNA表达水平和 sPLA2的浓度直线相关系数为 0.88,呈高度相关(P＜0.05)。当 sPLA2的浓度为 10 U/ml时,MCP-1的 mRNA水平较空白对照组增加 2.47倍,ICAM-1的mRNA水平较空白对照组增加 2.03倍。见图 2。

图2 不同浓度sPLA2刺激HUVEC后分泌的MCP-1和ICAM-1 mRNA表达水平的变化

3 讨 论

磷脂酶是一类广泛分布的酶类〔5〕,能以生物膜磷脂为天然底物,催化多种磷脂Sn-2为上的酯键水解产物,生成游离脂肪酸和溶血磷脂参与磷脂的代谢,是花生四烯酸,溶血卵磷脂等炎性介质生成的限速酶,参与多种急慢性炎症过程。sPLA2是其中一种亚型,除具有以上特点以外,还具有其他特性:属于钙非依赖型,相对分子质量为 14.4 kD,最适 pH值 7～9。在 AS的所有阶段,均能检测到sPLA2的表达增加。本文前期的研究中发现,sPLA2在AS大鼠血管平滑肌,心肌组织及脂肪组织中均表达增高,并且辛伐他汀能够将降低其在血管平滑肌细胞和心肌组织中的表达水平〔6〕。

MCP-1和ICAM-1与AS过程中的血管炎性损伤密切相关。MCP-1属于一种趋化因子,其主要功能是趋化和激活单核细胞至炎症部位。在 AS发展过程中,分泌的 MCP-1促进单核细胞黏附内皮细胞并透入内皮细胞形成泡沫细胞,导致 AS发生。ICAM-1主要表达于内皮细胞,正常状态下呈低水平表达,其介导的细胞间黏附在免疫应答的多个环节其作用,对淋巴细胞的浸润,活化和发挥效应等过程,在介导中性粒细胞稳定黏附和穿越内皮细胞向炎症部位的游出中起关键作用〔7〕。MCP-1还可促进内皮细胞表 ICAM-1,后者可介导白细胞和血管内皮细胞紧密黏附,并相互作用,相互激活,促进黏附分子,趋化因子,细胞因子大量表达,扩大炎症反应。将血管内皮细胞和单核巨噬细胞(THP-1)共培养,在磷脂酶 A2、白介素-1、肿瘤坏死因子、脂多糖等的刺激下,两者发生黏附增加,并且分泌的ICAM-1和血管细胞黏附分子-1均增加〔8〕。从眼镜蛇毒中分离得到的磷脂酶 A2主要为sPLA2〔9〕。本实验通过利用 sPLA2与 HUVEC共培养,发现与空白对照组相比,不同浓度的 sPLA2刺激 HUVEC分泌的MCP-1和ICAM-1蛋白和mRNA表达水平均有所增加,且随着sPLA2的浓度越高,MCP-1和 ICAM-1蛋白和 mRNA表达水平越高,具有显著相关性。从而证明,sPLA2可能是通过促进分泌一系列的炎性因子参与 AS的进程。但是 sPLA2是否 AS的启动因子,以及使用辛伐他汀等药物是否能够降低sPLA2和其他炎性因子等的表达,目前还需要进一步探讨和研究。

1 Ross R.Atherosclerosis an inflammatory disease〔J〕.N Engl J Med,1999;340(2):115-26.

2 Dennis EA.Thegrowingphospholipase A2superfamily of signal transduction enzymes〔J〕.Trends Biochem Sci,1997;22(1):1-2.

3 Hurt-Camejo E,Andersen S,Standal R,et al.Localization of nonpancreatic secretory phospholipase A2in normal and atherosclerotic arteries.Activity of the isolated enzyme on low-density lipoproteins〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997;17(2):300-9.

4 于 路,姜文兵,傅国胜,等 .冠心病患者分泌型磷脂酶 A2的变化及其与高敏 C反应蛋白的关系〔J〕.中国动脉硬化杂志,2006;14(10);884-6.

5 Menschikowski M,Hagelgans A,Siegert G.Secretory phospholipase A2of group IIA:is it an offensive or a defensive player during atherosclerosis and other inflammatory diseases〔J〕.Prostaglandins Other Lipid Mediat,2006;79(1-2):1-33.

6 Wei-hua L,Chang-qing S,Qiang X,et al.Simvastatin inhibits sPLA2IIa expression in aorta and myocardium〔J〕.Arch Med Res,2009;40(2):67-72.

7 Panes J,Granger DN.Leukocyte-endothelial cell interactions:molecular mechanisms and implications in gastrointestinal disease〔J〕.Gastroenterology,1998;114(5):1066-90.

8 Yokote K,Morisaki N,Zenibayashi M,et al.The phospholipase-A2reactiong leads to increased monocyte adhesion of endothelial cells via she expression of adhesion molecules〔J〕.Eur JBiochem,1993;217(2):723-9.

9 杨亚萍,梁中琴,顾振纶,等 .眼睛蛇毒分泌型磷脂酶 A2的研究进展〔J〕.中国药理学通报,2005;21(9):1045-8.