天花粉蛋白抑制 Hela细胞增殖的临床作用

李 军 杨慧玲 (郑州大学第一附属医院药学部,河南 郑州 450052)

天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是从葫芦科植物栝楼的块根中提取的一种蛋白质,为我国传统中药“天花粉”的有效成分,具有引产、抗肿瘤和抗免疫缺陷病毒(HIV)等多种生物学功能〔1,2〕。TCS属于单链核糖体失活蛋白(ribosomeinactivatingprotein,RIP),以往的研究主要集中在其引起细胞凋亡及相关基因表达方面。本文观察 TCS对宫颈癌 Hela细胞增殖的抑制作用,从细胞自噬的角度探讨TCS的抗肿瘤作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 宫颈癌细胞株Hela细胞购自武汉大学典藏中心,用含 10%小牛血清的 DMEM培养基(Gibco公司),在 5%CO2、37℃条件下培养,每 3d传代 1次。取对数生长期细胞进行实验。TCS为江苏天晴制药总厂产品,Beclin1和微管相关蛋白轻链 3(LC3)抗体购自美国 Santa Cruz公司,异硫氰酸荧光素(FITC)标记的IgG购自武汉凌飞公司,胆囊收缩素(cell counting kit,CCK-8)试剂盒由日本 Dojindo Laboratories生产;其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法检测 TCS对 Hela细胞增殖的抑制作用 取对数生长期 Hela细胞接种于 96孔板上(细胞数为每孔 1×105个),待细胞贴壁分别加入不同浓度的TCS,每个浓度设 6个复孔,对照组加入相同体积的培养液,继续培养 24、48、72 h,每孔加入 10μl CCK-8试剂,于 37℃、5%CO2培养箱孵育 1h,使用酶标仪检测 450 nm波长处吸光度值(A),以空白对照孔调零,按下列公式计算细胞生长抑制率:细胞生长抑制率 =(A对照组-A实验组)/A对照组。

1.2.2 单丹磺酰尸胺(MDC)荧光染色检测细胞自噬变化选择抑瘤效果明显的药物浓度 80μg/ml分别给药 3、6、12、24 h,使用含 MDC(0.05mmol/L)的新鲜培养基孵育 15 min,离心洗涤 2次后涂片,使用荧光显微镜加 356 nm发射滤片和545nm断滤片进行观察、摄片。

1.2.3 Western印迹检测细胞 Beclin1和LC3的表达 对数生长期 Hela细胞接种于 6孔板上,待细胞贴壁后加入 80μg/ml TCS,同时设立阴性对照,培养不同时间(0～24 h),用蛋白裂解液提取胞浆蛋白,考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。制备十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶,每孔上样量 100μg,常规电泳、转膜、封闭,37℃封闭 1 h,加入 Beclin1(1∶1 000)和 LC3抗体(1∶500)4℃孵育过夜,碱性磷酸酶标记二抗(1∶3 000),室温孵育 2 h,碱性磷酸酶染色 5 min,暗室内 X光胶片曝光显影。图像应用 TotalLab2.0软件进行灰度分析并进行统计学处理。1.3 统计学处理 应用 SPSS13.0统计软件,数据以±s表示,组间比较采用t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1 TCS对 Hela细胞的生长抑制作用 结果显示TCS能够显著抑制 Hela细胞的生长,且此作用呈现明显的时间和剂量依赖性。见表 1。

表1 TCS对Hela细胞生长的抑制率(%)

2.2 细胞自噬的形态学改变 TCS(80μg/ml)作用 3 h后,可见绿色点状荧光颗粒散布于细胞的胞质内,这一效果一直持续到 24h后,且在给药 6 h后自噬囊泡的数量最多,对照组则无此现象。

2.3 Beclin1和 LC3蛋白的表达 在 TCS分别作用于 Hela细胞 0、3、6、12、24 h后自噬特异性蛋白 Beclin1的相对灰度值为0.29±0.03、1.21 ±0.15、2.11±0.24、0.97 ±0.17、0.65 ±0.04;LC3相对灰度值为 0.35±0.02、1.28±0.11、2.18±0.21、1.05±0.19、0.61±0.06。差异均有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨 论

自噬是一种从酵母到人类都存在的、高度保守的细胞行为,真核细胞借此来维持细胞生物合成和分解代谢之间的动态平衡,这一过程在清除细胞内衰老的蛋白、细胞器及细胞器的构建中起到重要作用,并与多种疾病和肿瘤的发生、发展密切相关〔3〕。TCS的抗肿瘤作用机制主要表现为诱导细胞凋亡、抑制细胞蛋白质的合成及促进自然杀伤(NK)细胞的活性等方面〔4〕,通过观察自噬是否参与了 TCS对 Hela细胞的生长抑制作用,可更好地阐明TCS的抗肿瘤作用机制。

本实验中使用 TCS处理人宫颈癌细胞株Hela细胞,CCK-8结果显示TCS可显著抑制 Hela细胞的增殖,且此作用呈现明显的时间和剂量依赖性;MDC荧光染色结果显示 TCS给药后3 h可诱导Hela细胞发生自噬,这一效果一直持续到 24 h后。Beclin1是酵母 ATG6基因在哺乳动物中的同源类似物,位于人类染色体 17q 21上,是自噬信号通路上第一个被确认的肿瘤抑制分子〔5〕;LC3是酵母 ATG8在哺乳动物中的同源类似物,其脂质修饰形式位于自噬泡膜的表面,现已作为自噬的特异性标记蛋白〔6〕。Western印迹结果显示,TCS作用 Hela细胞 3 h后自噬特异性蛋白 Beclin1和 LC3水平显著升高,这一水平一直持续到 24 h后。这一结果说明,TCS能够诱导 Hela细胞自噬水平的提高,且自噬活化与 Beclin1和 LC3蛋白的激活有关。在以后的研究中需要对自噬在这一过程的作用进行进一步的研究,以便为可能开发以自噬为基础的宫颈癌治疗药物提供新的方向。

1 Shaw PC,Chan WL,Yeung HW,et al.Minireview:trichosanthin-a protein with multiple pharmacological properties〔J〕.Life Sci,1994;55(4):253-62.

2 Shaw PC,Lee KM,Wong KB.Recent advances in trichosanthin,a ribosome-inactivating protein with multiple pharmacological properties〔J〕.Toxicon,2005;45(6):683-9.

3 Levine B,Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease〔J〕.Cell,2008;132(1):27-42.

4 张 茹,黄利鸣,岑畅飞.天花粉蛋白作用机制研究进展〔J〕.时珍国医国药,2009;20(12):3116-7.

5 Yue Z,Jin S,Yang C,et al.Beclin 1,an autophagy gene essential for early embryonic development,is a haploinsufficient tumor suppressor〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2003;100(25):15077-82.

6 Galluzzi L,Aaronson SA,Abrams J,et al.Guidelinesfor the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes〔J〕.Cell Death Differ,2009;16(8):1093-107.