血浆激肽释放酶 B1和缓激肽受体 B2基因多态性及体质指数与老年原发性高血压的关系

邹 力 李法琦 周 平 陈大林 (重庆医科大学附属第一医院老年病科,重庆 40006)

原发性高血压是与多个遗传基因有关的复杂性疾病,是多种心脑血管疾病重要的病因和危险因素之一。激肽释放酶-激肽系统(KKS)参与高血压发生发展的各个过程,其组成部分血浆激肽释放酶 B1(KLKB 1)和缓激肽受体B2(BDKRB2)等在血压和肾钠调节中发挥重要作用。KLKB1基因和 BDKRB2基因是参与高血压发病的候选基因之一〔1～3〕。近年来,虽有较多BDKRB2基因多态性与原发性高血压关系的病例对照研究文献报道,但不同人种不同地区的研究结果缺乏一致性,并且KLKB1和BDKRB2基因多态性与老年汉族人群高血压的关系报道很少。流行病学研究表明体质指数(BMI)与高血压发病密切相关〔4〕,而关于 KLKB1和 BDKRB2基因多态性与 BMI之间的协同作用尚无报道。我们应用限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(RFLP-PCR)技术检测重庆地区老年汉族原发性高血压患者的 KLKB1和BDKRB2基因多态性,为进一步研究老年原发性高血压发病机制提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 各组受检者均为无血缘关系重庆地区老年汉族人群。老年原发性高血压组共 103例,男 65例,女 38例,平均年龄(69.83±0.61)岁,均为本院体检中心的体检病人,经临床及实验室检查确诊为老年原发性高血压患者,符合 1999年WHO/ISH高血压防治指南的诊断标准〔4〕:收缩压(SBP)≥140mmHg和(或)舒张压(DBP)≥90 mmHg,排除继发性高血压、冠心病、先天性心脏病、心肌病、风湿性心瓣膜病、糖尿病、肝肾功能不良等。老年正常对照组共 103例,男 66例,女 37例,平均年龄(67.06±0.60)岁,均为我院体检中心的健康老年体检者,血压 ＜140/90 mmHg,无心脑血管病、糖尿病、肝肾功能不良等。所有研究对象由经验丰富的技术人员测量其身高、体重并计算 BMI。

1.2 仪器与试剂 S1000 Thermal Cycler PCR仪和凝胶/发光图像分析系统购自美国BioRad公司;DYY-6C型电泳仪购自北京市六一仪器厂;600型恒温水浴箱购自江苏省金坛市中大仪器厂;血液基因组DNA提取试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司生产;实验所用的引物是根据NCBI数据库的基因序列,应用碱基错配法〔5,6〕构建酶切位点和 Primer5.0软件自行设计,由上海生工生物工程技术服务有限公司和英俊生物技术有限公司合成;Hotstart-TaqDNA聚合酶、Mlu-Ⅰ和 Xsp-Ⅰ限制性内切酶为宝生物(大连)工程有限公司产品。

1.3 方法 ①提取血基因组:所有研究对象早晨采空腹静脉血 5 ml,分离血清检测其尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和血糖等相关生化指标;另取空腹静脉血 2 ml使用血液基因组 DNA提取试剂盒提取DNA,-20℃保存。②KLKB 1基因 rs2304595位点目的片段PCR扩增与酶切消化:上游引物 5-CCCAGAAGAATAAAATTTGACGC-3;下游引物:5-GAGTAGAGGAACTTGGTGTGC-3。 PCR反应体积:模板 DNA约 100 ng,HotStart-Taq酶 0.15 U,上下游引物均 0.1μmol/L,dNTP 0.56μl,10×PCR Buffer 0.7μl,加双蒸水调至总体积 7μl。PCR反应条件:94℃预变性 5 min,然后 94℃变性 30 s,53℃退火 25 s,72℃延伸 25 s,共 45个循环,最后 72℃延伸 5 min。限制性内切酶消化反应总体积9μl,PCR产物 7μl,Mlu-Ⅰ限制性内切酶 7 U,10倍 H Buffer和双蒸水共 2μl,37℃恒温水浴箱酶切过夜。酶切产物用 3%琼脂糖凝胶电泳,GoldenView染色,紫外灯下观察结果并拍照。③BDKRB2基因rs1799722位点目的片段 PCR扩增与酶切消化:上游引物:5-CAGAGCGGAGAGCGAAGGTGG-3;下游引物:5-GCTCATCTTTCAAGGGCTGGCTA-3。PCR反应体积:模板 DNA约100ng,HotStart-Taq酶 0.15 U,上下游引物均 0.1μmol/L,d NTP 0.48μl,10倍 PCR Buffer 0.6μl,加双蒸水调至总体积6μl。PCR反应条件:94℃预变性 5min,然后 94℃变性 30s,57℃退火 25 s,72℃延伸 25 s,共 45个循环,最后 72℃延伸5 min。限制性内切酶消化反应总体积 9μl,PCR产物 6μl,Xsp-Ⅰ限制性内切酶 12 U,10倍 K Buffer和双蒸水共 3μl,37℃恒温水浴箱酶切过夜。酶切产物用 3%琼脂糖凝胶电泳,GoldenView染色,紫外灯下观察结果并拍照。

1.4 统计学处理 所有数据采用 SPSS13.0统计软件进行分析,数据用±s表示,计数资料采用χ2检验,计量资料采用t检验,遗传平衡检验采用 Hardy-Weinberg平衡定律,高血压的危险因素采用 Logistic回归分析。

2 结 果

2.1 两组人群的基本临床资料的比较 老年汉族原发性高血压组 SBP、DBP、BMI的检验结果显著高于正常对照组(P＜0.05),而年龄、性别、身高、体重、BUN、Cr、UA、TC、TG、HDL-C、LDL-C和血糖两组间无显著性差异(P＞0.05)。见表 1。

2.2 Harding-Weinberg平衡检验 经 χ2检验老年汉族原发性高血压组和老年汉族正常对照组的 KLKB1基因 rs2304595位点基因型分布以及 BDKRB2基因rs1799722位点基因型分布均未偏离 H-W平衡(P＞0.05)。

2.3 KLKB1基因rs2304595位点多态性分析 3%琼脂糖凝胶电泳显示 rs2304595位点的GG野生型纯合子为 1个 147 bp的条带,AA突变型纯合子为 1个 169 bp的条带,GA突变型杂合子则同时具有 147 bp和 169 bp两个条带。见图 1。KLKB1基因型 GG基因型和G等位基因携带者老年原发性高血压发病风险(OR值)分别是正常对照组的 1.60倍和 1.49倍,检验GG基因型和 G等位基因频率差异无统计学意义(P=0.093和P=0.058)。在老年原发性高血压男性亚组和正常对照男性亚组中 GG基因型和 G等位基因的频率差异无统计学意义(P=0.93和 P=0.89);但是,在老年原发性高血压女性亚组和正常对照女性亚组中 GG基因型和 G等位基因的频率,差异显著(χ2=7.302,P=0.007和 χ2=8.204,P=0.004),并且 GG基因型和 G等位基因女性携带者老年原发性高血压发病风险(OR值)明显增高,分别是女性正常对照组的 3.71倍和 2.74倍。见表 2。

表1 两组人群的临床和生化检查资料(±s,n=103)

表1 两组人群的临床和生化检查资料(±s,n=103)

与正常对照组比较:1)P＜0.05

组别 原发性高血压组 正常对照组身高(cm) 159.82±0.85 160.72±0.78体重(kg) 63.66±0.84 60.43±0.98 SBP(mmHg) 153.58±2.081) 133.26±1.38 DBP(mmHg) 83.38±1.491) 74.94±0.89 BMI(kg/m2) 24.97±0.271) 23.30±0.28 BUN(mmol/L) 5.70±0.14 5.95±0.22 Cr(μmol/L) 75.23±2.03 74.74±1.53 UA(μmol/L) 363.84±9.21 318.97±6.89 TC(mmol/L) 5.21±0.10 5.03±0.08 TG(mmol/L) 1.50±0.07 1.54±0.09 HDL-C(mmol/L) 1.15±0.06 1.45±0.04 LDL-C(mmol/L) 2.23±0.12 2.54±0.07血糖(mmol/L) 5.28±0.06 5.33±0.12

图1 rs2304595位点电泳图片

2.4 BDKRB2基因rs1799722位点多态性分析 3%琼脂糖凝胶电泳显示 rs1799722位点 CC野生型纯合子为 1个 126 bp的条带,TT突变型纯合型为 1个 148 bp的条带,CT突变型杂合子则同时具有 126 bp和 148 bp两个条带。见图 2。原发性高血压组和正常对照组 CC、CT、TT型基因频率和 C、T等位基因频率无差异(P=0.43和 0.28),并且各性别亚组 CC基因型和C等位基因频率差异也无统计学意义(P＞0.05),见表 3。

表2 两组 KLKB1基因 rs2304595基因型与等位基因分布频率比较〔n(%),n=103〕

与正常对照组女性比较:1)P＜0.05

图2 rs1799722位点电泳图片

表3 两组BDKRB 2基因 rs1799722基因型与等位基因分布频率比较〔n(%),n=103〕

2.5 BMI与血压的关系 BMI≥25 kg/m2个体老年原发性高血压发病风险明显高于老年正常对照组(OR=3.62),老年原发性高血压发病差异有显著统计学意义(χ2=17.21,P＜0.000 1),且随 BMI的增大发病风险呈趋势性增高。见表 4。

表4 两组 BMI与血压的关系〔n(%),n=103〕

2.6 Logistic回归分析 老年原发性高血压发病危险因素的Logistic回归分析结果表明:KLKB1基因rs2304595位点 GG基因型和BMI均不同程度地增加老年原发性高血压发病的危险性(GG基因型:OR=4.474,95%CI:2.284～8.766;BMI:OR=3.302,95%CI:1.707～6.387),二者之间存在协同作用,其中GG基因型对老年原发性高血压发病的影响更大(P＜0.01)。而 BDKRB 2基因rs1799722位点CC基因型对老年原发性高血压发病无影响(P＞0.05)。见表 5。

表5 Logistic回归分析

3 讨 论

KLKB1和BDKRB2基因分别位于人类染色体区域 4q34-q35和 14q32.1-q32.2,是参与原发性高血压发病的候选基因之一〔2,3,6,7〕。本项研究中的老年原发性高血压组和老年正常对照组均是重庆地区汉族人群,基因型分布检验符合 Hardy-Weinberg平衡定律,说明本项研究结果具有一定的群体代表性。目前已有KLKB1基因 rs2304595位点A/G多态性和原发性高血压发病相关的报道〔6〕,但尚未见该基因多态性与老年汉族人群高血压发病有关的阳性报道。本项研究表明 GG基因型和 G等位基因可能是老年汉族女性原发性高血压发病的一个遗传标志。BDKRB2基因 rs1799722位点的T/C基因多态性的研究报道之间缺乏一致性。 Mukae等〔2〕报道日本人群〔2〕、Wang等〔8〕报道我国汉族人群以及有关非洲裔美国人群的报道〔3,7〕发现 rs1799722位点 CC基因型携带者的原发性高血压发病明显高于对照组,而 Fu等〔9〕报道日本人群、李南方等〔10〕报道中国哈萨克族人群以及西方高加索人群(Caucasian)的报道〔7,11〕认为该位点 T/C基因多态性与原发性高血压发病无关。本研究发现重庆地区老年汉族原发性高血压组和正常对照组CC基因型和 C等位基因无差异,并且在男女亚组中也未发现有差异。这些研究结果之间缺乏一致的原因可能是由于西方高加索人群和中国哈萨克族人群构成复杂、DNA的种族多样性、基因内部结构的细微差异所致,也可能是因为高加索人群、日本人群和本项研究对象的选择标准、地域环境和生活习惯存在差异等因素所造成。

上述统计结果是把KLKB1和 BDKRB 2基因多态性作为老年原发性高血压发病原因的单个因素来考察的,而环境因素对原发性高血压的发病起重要作用。流行病学调查证实肥胖或超重是与原发性高血压密切相关的危险因素,肥胖能够导致和加重许多心血管疾病。亚太地区肥胖与超重标准专题研讨会提出 BMI≥25 kg/m2为肥胖,BMI与血压呈显著的正相关,前瞻性研究表明,基线 BMI每增加 1kg/m2,高血压发病危险 5年内增加 9%〔4,12〕。本研究表明 KLKB1基因 rs2304595位点 GG基因型和BMI均不同程度的增加老年原发性高血压的发病风险,且二者协同作用影响高血压的发病,其中 GG基因型对高血压发病的影响更大。因此,降低BMI是削弱KLKB1基因 GG基因型对老年原发性高血压发病的良好措施。

1 Yu H,Bowden DW,Spray BJ,et al.Identification of human plasma kallikrein gene polymorphisms and evaluation of their role in end-stage renal disease〔J〕.Hypertension,1998;31(4):906-11.

2 Mukae S,Aoki S,Itoh S,et al.Promoter polymorphism of thebeta2bradykinin receptor gene isassociated with essential hypertension〔J〕.Jpn Circ J,1999;63(10):759-62.

3 Gainer JV,Brown NJ,Bachvarova M,etal.Altered frequency of apromoter polymorphism of the kinin B2 receptor gene in hypertensive African-A-mericans〔J〕.Am J Hypertens,2000;13(12):1268-73.

4 王吉耀.内科学〔M〕.北京:人民卫生出版社,2002:229-34.

5 李洪义,曾瑞萍,杜传书.用一对错配引物进行的 PCR/酶解法检测β-地中海贫血-28(A→G)突变〔J〕.中山医科大学学报,1993;14(4):封 2,封 4.

6 Lu X,Zhao W,Huang J,et al.Common variation in KLKB1 and essential hypertension risk:tagging-SNP haplotype analysis in a case-control study〔J〕.Hum Genet,2007;121(3-4):327-35.

7 Cui J,Melista E,Chazaro I,et al.Sequence variation of bradykinin receptors B1 and B2and association with hypertension〔J〕.J Hypertens,2005;23(1):55-62.

8 Wang B,Dang A,Liu G.Genetic variation in the promoter region of the beta2 bradykinin receptor gene is associated with essential hypertension in a Chinese Han population〔J〕.Hypertens Res,2001;24(3):299-302.

9 Fu Y,Katsuya T,Matsuo A,et al.Relationship of bradykinin B2 receptor gene polymorphism with essential hypertension and left ventricular hypertrophy〔J〕.Hypertens Res,2004;27(12):933-8.

10 李南方,汪迎春,周 玲,等 .缓激肽 β2受体基因启动子区-58T/C多态性与哈萨克族原发性高血压的相关性分析〔J〕.医学分子生物学杂志,2008;5(2):110-3.

11 Milan A,Mulatero P,Williams TA,et al.Bradykinin B2 receptor gene(-58T/C)polymorphism influences baroreflex sensitivity in never-treated hypertensive patients〔J〕.JHypertens,2005;23(1):63-6.

12 Mori MA,Araujo RC,Reis FC,et al.Kinin B1 receptor deficiency leads to leptin hypersensitivity and resistance to obesity〔J〕.Diabetes,2008;57(6):1491-500.