植物生长调节剂在魔芋愈伤组织培养中的应用研究

欧阳达,张淑贞,付腾腾,戴思维 (长江大学农学院,湖北荆州434025)

魔芋 (Amorphophalms konjac)为天南星科魔芋属多年生草本植物,中国为其主产国之一,其主要成分为葡甘露聚糖,是一种重要的保健食品,同时是一种新材料和新资源,因而广泛用于医药和工业。近年来深加工产品出口量加大,市场需求量大,供不应求,导致产业结构调整,使魔芋成为山地主要的经济作物之一。而传统的繁殖方法效率低下,使魔芋的品质下降,阻碍了魔芋的大面积生产,制约着魔芋产业的发展。近些年,很多研究者将植物组织培养技术应用于魔芋的种球繁殖上,试图解决魔芋的种苗短缺和品质下降等问题,取得了一定效果[1～6]。本研究通过对魔芋的愈伤诱导、分化和生根诱导等进行试验,试图为魔芋良种繁育和产业化提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为魔芋块茎,采用野生的魔芋块茎为外植体,经过严格的消毒处理后用于实验。以MS(蔗糖30g/L、琼脂8g/L、pH5.8)为基本培养基,通过与植物生长调节剂结合形成不同的组合培养基。选用的植物生长调节剂为NAA和6-BA。

1.2 材料处理及外植体灭菌

将采集的材料洗净,置于无菌操作台上,然后切成2cm×2cm×2cm小方块,放入70%的酒精浸泡约1min,然后用0.1%HgCl溶液中灭菌10min,然后用无菌水冲洗5次,切割成5mm×5mm×5mm小方块,接种于培养基上。

1.3 愈伤组织诱导

以MS为基本培养基,附加6-BA和NAA不同水平形成不同的组合培养基:组合培养基CM1组成为MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA,CM2为MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA,CM3为MS+1.50mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA,CM4为MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA,CM5为MS+1.0mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA。在避光、(26±2)℃条件下进行组织培养。

1.4 愈伤组织继代及分化

继代培养基:CM2和CM4、CM2+柠檬酸和CM4+柠檬酸、CM2+维生素C和CM4+维生素C。组织培养在避光、(26±2)℃条件下进行。分化培养基:CM3、CM6(MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)、CM7(MS+2.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)、CM8(MS+3.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)。在光照14h/d、(26±2)℃条件下进行组织培养。

1.5 愈伤组织生根培养

培养基为1/2MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。在光照14h/d、(26±2)℃条件下进行组织培养。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导

块茎切块接种于不同的培养基上,经过10d左右的暗培养,表面逐渐变成褐色,随后出现膨大,质地疏松,颜色为粉红色。20d后出现致密的芽点,愈伤组织明显膨大,质地变得相对紧密。试验结果显示,在CM2和CM4 2个组合培养基上,愈伤组织的生长速度和诱导效果最好。诱导率分别为71.7%和56.4%。诱导愈伤组织的最佳组合为CM2,即MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA。

2.2 愈伤组织的继代及分化

在试验条件下,CM4内的愈伤组织增长速度和愈伤组织的质量最好,在此条件下的愈伤组织能够很好的增殖,褐化的程度最轻,愈伤组织的颜色呈现粉红色。其他培养基内的愈伤组织大多呈现白色、淡绿色质地较粉红色愈伤紧密,生长速度较缓慢,随时间的推移逐渐变为淡褐色的愈伤组织。愈伤组织增殖最佳组合为CM4,即MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。

形成的愈伤组织的继代时期为第21d,此时转入继代培养基最佳,过早过晚都不利于其繁殖。将愈伤组织切成5mm×5mm×5mm小方块转入分化培养基上,进行不定芽的诱导和增殖培养。10d后在部分愈伤组织上分化出芽点,经过20d左右大多数愈伤组织的表面开始陆续出现凹凸不平的生芽点,其中小部分不定芽长到3cm左右,30d后不定芽分化出绿色的叶片。

虽然CM2是诱导愈伤组织的最佳培养基,但在增殖阶段CM4中的愈伤组织生长状况总体比CM2的好。即含植物调节生长调节剂较少的培养基有利于愈伤组织的增殖。同样在芽分化的诱导中,CM6的效果较好且利于接下来的根分化实验的进行,可能是经历了植物生长调节剂浓度的低-高-低的变化后有效避免了褐化问题,这一点与黄远新等[1]的研究相一致。

2.3 试管苗的的诱导

由于魔芋的芽为叶芽,且仅一片复叶,茎的生长点在叶柄的基部内。因此,当分化形成的植株进入岀叶期时,需要连同少量的愈伤组织一起切下来转入培养基中诱导生根。试验结果表明,经过7d诱导,即有少量的根毛状不定根出现,21d后在培养基内部可见大量的白色根系生成,生根率高达100%。

3 结论与讨论

1)在适当的培养条件下,不同培养基均能诱导愈伤组织的形成。6-BA和NAA过高过低都不利于愈伤组织的诱导,诱导愈伤组织的最佳组合为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA,愈伤组织增殖最佳组合为MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA;愈伤组织芽分化最佳的培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA。

2)培养效果主要取决于6-BA与NAA浓度比。NAA浓度应维持在较低水平,在此前提下,比值低则利于愈伤组织诱导,比值高则利于不定芽分化。这与黄丹枫等[6]的研究结果是一致的。

3)采用降低无机盐和激素浓度,并结合生长调节剂浓度低一高一低交替采用,以及控制光照等,可在愈伤组织褐化上取得良好效果。褐化是植物组织培养过程中影响培养物继续生长、增殖和后续的诱导分化,还是寄栽成活率高低的主要因子。导致离体培养组织褐化的因素很多,木本植物克服褐化的办法常采用改变培养方式、培养时间及培养过程中控制光照强度等。在魔芋组织培养中,这方面研究很少。本研究所进行的相关试验仅仅是初步探索,为科学指导生产尚需进一步开展比较系统地试验研究,特别是大田实证试验研究。

致谢:本研究得到长江大学农学院周燚副教授大力帮助,在论文写作和修改中得到长江大学国家大学生创新性实验计划项目指导老师朱建强教授的悉心指导,在此谨致谢忱!

[1]黄远新,何凤发,张盛林.魔芋组织培养与快繁技术研究 [J].西南农业大学学报,2003,25(4):309-312.

[2]马崇坚,彭诚聪.魔芋块茎组织培养及植株再生[J].江苏农业科学,2007,(3):103-105.

[3]吕世安,沈艳芬,黄元勋,等.魔芋组织培养及试管苗快繁原原种芋技术研究 [J].湖北农业科学,2003,(6):68-70.

[4]谢玲玲,赵青华,降巧龙.魔芋茎尖脱毒试管苗培养基的筛选 [J].安徽农业科学,2008,36(34):14891.

[5]谢玲玲,赵青华,降巧龙.魔芋茎尖试管苗培养基的筛选与优化 [J].安徽农业科学,2009,37(30):14627-14628.

[6]黄丹枫,陆文初.细胞分裂素与魔芋组织培养器官发生研究 [J].西南农业大学学报,1993,15(6):522-526.