壳聚糖对黄鳝非特异性免疫机能的影响

曹志华 (长江大学动物科学学院,湖北荆州434025)

温小波 (华南农业大学动物科学学院,广东广州51 0632)

严书林 (长江大学动物科学学院,湖北荆州434025)

壳聚糖 (chitosan)是甲壳素脱乙酰基后生成的直链多糖,是一种重要的天然活性物质。目前,由于抗生素的使用带来的负面影响越来越突出,对免疫刺激物的研究也越来越受到重视。但壳聚糖在鱼类的使用中还处于研究和探索阶段[1-5]。目前,有关壳聚糖对鱼体白细胞吞噬活性和溶菌酶溶菌活力及其他抗病力的研究虽然不少,但有关黄鳝的研究还未见报道。为此,本研究在黄鳝 (Monopterus albus Zuiew)饲料中添加壳聚糖,测定其血液白细胞吞噬活性和血清中溶菌酶活性,初步探讨其对黄鳝非特异性免疫机能的影响,以期为黄鳝的疾病预防提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

受试黄鳝来源于长江大学动物科学学院水产基地,体重16.8～24.3g,暂养1周后,挑选体色正常、体质健壮、健康无病的个体用于试验。试验所用壳聚糖为自制,其制备方法参考文献[5-9],具体如下:收集新鲜的虾壳,先去除虾壳内外表面的异物,然后经脱钙、脱色等工序制成甲壳素,其工艺流程为:蟹壳→水洗→碱浸→水洗→酸泡→脱色→水洗→干燥→粉碎→成品。将甲壳素与50%的氢氧化钠溶液在三口烧瓶中混合搅拌,在70℃下回流12h,过滤、洗涤、烘干即得所需产品。经测定,所提取的产品含壳聚糖38.33g/100g,蛋白质32.06g/100g,粗脂肪g/100g,钙10.74g/100g。

1.2 试验方法

试验共分6组 (Ⅰ～Ⅵ),每组3个平行,共计18个水箱 (规格为60cm×45cm×45cm,箱中放入黑色塑料袋以供黄鳝藏身,水深15cm左右),每箱放鱼30尾。各组试验鱼分别饲喂在基础饲料中添加0.0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0g/100g壳聚糖的对应组别饲料,各组别饲料配方详见表1。各组试验鱼每天分别按其体重的2%～3%投喂对应组别饲料1次,1h后清除箱中的污物,每隔3d换掉箱中2/3的水。饲养期间水温控制在23～25℃,充气泵间歇增氧 (每隔45min增氧10min)。

表1 各组试验饲料原料组成 g/100g

1.3 免疫指标测定

在试验开始后0、10、25、50d每次分别从每组黄鳝中随机抽取3尾,测定其血液白细胞的吞噬活性、血清溶菌酶活性和抗菌活性,其测定与计算方法参照文献[10]。

2 结果与分析

各组黄鳝不同时间的白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活性和抗菌活性的测定结果详见表2。由表2可知,随着壳聚糖添加量的增加,各组黄鳝白细胞的吞噬活性、抗菌活性和血清溶菌酶活性出现上升趋势,在0.5～1.5g/100g时最高,但当壳聚糖的添加量达到2.0g/100g时,白细胞的吞噬活性、血清溶菌酶活性和抗菌活性都明显下降。

表2 各组黄鳝不同时间的白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活性和抗菌活性

壳聚糖对黄鳝白细胞的吞噬活性和抗菌活性及溶菌酶的活性随养殖时间的不同而出现不同的结果,同一组在10d、25d和50d的测定结果有明显的不同。壳聚糖添加量为0.2g/100g的试验组在不同时间测定的结果出现上升趋势,添加量为0.5g/100g的试验组在3个时间点测定的结果都比对照组高,而添加量为1.0g/100g和1.5g/100g的2个试验组白细胞的吞噬活性和抗菌活性在第10天和第25天的结果虽比对照组高,但第50天的抗菌活性和白细胞的吞噬活性则出现明显下降。壳聚糖添加量为2.0g/100g的试验组,其第10天的白细胞吞噬活性和抗菌活性比其它时间段的测定结果要高 (表2)。

3 讨论

鱼类的非特异性免疫主要包括体液免疫和细胞免疫。在细胞免疫中,血液中的吞噬细胞起着重要的作用[9]。本研究结果表明,在饲料中添加适量的壳聚糖能增强黄鳝白细胞的吞噬活性。5个添加壳聚糖的试验组,有4个试验组的黄鳝白细胞吞噬活性显著高于对照组。当壳聚糖的添加量从0.5g/100g上升到1.5g/100g时,黄鳝的白细胞吞噬活性也随之增强;但当添加量继续上升为2g/100g时,PP值和PI值并不增大。从投喂时间看,当投喂时间大于50d,1.0g/100g组和1.5g/100g组的白细胞吞噬活性和溶菌酶活性会下降,而添加2.0g/100g的壳聚糖对黄鳝的非特异性免疫在第10d测定指标达到最高,之后明显下降。这说明壳聚糖的添加量和使用持续的时间都会影响黄鳝的免疫应答水平,壳聚糖的添加量在0.5g/100g时,免疫应答水平随着时间的增加不会出现下降,而在比较高的添加水平随着壳聚糖的添加量的逐渐增加,黄鳝的免疫应答水平也随之增强,但超出一定时间后,鱼体的免疫应答水平不会持续上升,反而出现下降。所以要发挥壳聚糖的免疫刺激作用,使用时间和使用量是很重要的因素。

溶菌酶是鱼类血清中极为重要的非特异性免疫指标之一,测定鱼类的溶菌酶活性,可以在一定程度上反映鱼类非特异性体液免疫状态。当机体受到病源攻击时,吞噬细胞的活性增强,也导致溶菌酶活性的变化。本研究中,添加适量的壳聚糖使白细胞吞噬活性和血清溶菌酶活性的变化趋势基本一致,说明壳聚糖能够激活吞噬细胞的吞噬功能和水解酶的活性,增强机体的抗感染能力。当添加量在0.5～1.5g/100g时,在试验开始后第10天、第25天、第50天,添加壳聚糖的各试验组黄鳝溶菌酶活性呈上升趋势,当添加量壳聚糖达2g/100g时,随着时间的增加,高剂量的壳聚糖免疫效果并不会增强,反而出现下降,这一结果与王树芹等的研究相符的[3]。也有研究认为,将甲壳素注射到金头鲷体内,其溶菌酶的活力增强,而添加到饲料中无效[4],其与本研究结果不符的原因可能是因为壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基产物,它们的作用机制有所不同,而且壳聚糖的来源非常广泛,不同来源及加工工艺提取的壳聚糖会有一些差异,对鱼产生的影响也会有所不同。

[1]陈 勇,周洪琪,冷向军,等.壳聚糖对异育银鲫生长和消化酶的影响 [J].中国水产科学,2006,13(3):440-443.

[2]翟少伟,王 敦,黄沧海.昆虫壳聚糖对鲫鱼生长及肠道消化酶活性的影响 [J].云南农业大学学报,2009,24(4):566-569.

[3]王树芹,周洪琪.壳聚糖对异育银鲫溶菌酶和白细胞吞噬活性的影响 [J].上海水产大学学报,2004,13(2):121-125.

[4]Eateban M A,Cuesta A,Ortuno J,et al.Immunomodulatory effects of dietary intake of chitin on gilthend seabrean(Sparus autata L.)innate immune system[J].Fish Shellfish immmunology,2001,11:303-315.

[5]庄承纪,刘劲科,杨清友,等.壳多糖对罗氏沼虾,斑节对虾虾苗生长和抗菌防病作用的研究[J].湛江海洋大学学报,1998,18(3):29-34.

[6]欧阳涟,谢 宇,洪小伟.化学法制备壳聚糖的研究[J].河南工业大学学报 (自然科学版),2009,30(6):56-58.

[7]陈东辉,陈 亮.壳聚糖制备方法的比较研究 [J].化学研究与应用,2002,14(1):56-58.

[8]王 勇,张成钢,张 舟,等.高活性壳聚糖的制备及特性[J].微生物学杂志,2001,21(1):27-28.

[9]张子涛,陈东辉.甲壳素脱乙酰化及其动力学研究 [J].青岛大学学报,2000,15(4):23-26.

[10]曹志华,文 华,温小波,等.维生素C对黄鳝非特异性免疫机能的影响 [J].长江大学学报 (自然科学版)农学卷,2008,5(4):41-44.