河南猪株旋毛虫分子鉴定

王丽娜，路国兵，杨晓东，高 云，陈晓宁

（承德医学院，河北承德 067000）

河南猪株旋毛虫分子鉴定

王丽娜，路国兵，杨晓东，高 云，陈晓宁△

（承德医学院，河北承德 067000）

目的:通过分析河南猪株旋毛虫18S rRNA基因同源性序列，对旋毛虫进行分子鉴定及分类。方法:收集旋毛虫成虫，提取总RNA，反转录合成cDNA，经特异引物扩增获得18S rRNA基因片段，将此目的基因与 pMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞。阳性克隆经酶切鉴定后进行序列测定及分析。结果:河南猪株旋毛虫与亲缘关系较近虫株Trichinella nativa(AY487254.1)的同源性达99%。结论:河南猪株旋毛虫归属于T.nativa。

旋毛虫；鉴定；18S rRNA；系统发育树

旋毛虫病(trichinellosis)是一种严重的人兽共患寄生虫病，可感染人及150多种哺乳动物，呈全球性分布，并被列为三大人兽共患寄生虫病之首(旋毛虫、囊虫及棘球蚴）[1]。近年来，旋毛虫病的流行范围进一步扩大，发病率有逐年升高的趋势[2]。自发现旋毛虫以来，毛形属的分类问题一直被人们所关注，目前国际上已将毛形属分为8个隔离种和3个分类地位尚未确定的基因型(T6、T8、T9)[3]。由于旋毛虫属种分类复杂，本研究从分子遗传的角度分析了河南猪分离株18S rRNA的序列，并进一步探讨其归属问题。

1 材料与方法

1.1 旋毛虫来源 旋毛虫株(河南株）由本教研室小鼠传代保种。

1.2 实验动物 健康成年雄性昆明小鼠，20-25g，购自承德医学院实验动物中心。健康成年雄性SD大鼠，180-220g，购自河北医科大学实验动物中心。

1.3 主要试剂 胃蛋白酶(1：3000)、逆转录试剂盒，上海生物工程技术有限公司；载体pMD-18T、Tag DNA聚合酶、内切酶EcoRⅠ和HindⅢ，大连宝生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、琼脂粉，英国Oxoid公司；氨苄青霉素，美国Amresco公司；DNA marker，北京泰格美科技有限公司；DNA片段凝胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒，北京三博远志生物技术有限公司。

1.4 收集旋毛虫成虫 处死保种小鼠，分离全身肌肉，捣碎后采用改良贝氏法收集囊包幼虫。收集到的囊包幼虫经口感染大鼠，8000条/只，第5d处死，取全部小肠，纵向剪开，无菌生理盐水洗净，37℃温箱孵育2h，孵育液

200目纱网过滤，冲洗纱网洗下成虫，沉淀收集干净成虫，-80℃冰箱保存备用。

1.5 RT-PCR扩增18S rRNA基因 取旋毛虫成虫100mg，Trizol法提取旋毛虫成虫总RNA。引物序列为：P1：5′-AAGCTTGCTTGTCTCAAAGATT-3′，P2：5′-GA TCCTTCCGCAGTTCACCTAC-3′，由上海生物工程技术有限公司合成。RNA定量后逆转录反应制备cDNA， 20μl反应体系，反应条件：42℃、15min，95℃、5min，4℃、5min。以该cDNA为模板，按PCR扩增试剂盒说明操作，PCR反应体系为50μl。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃、1min，55℃、1min，72℃、2 min，35个循环，72℃延伸10min。取5μl PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 目的基因分子克隆和鉴定 按试剂盒说明回收电泳后的PCR产物。取适量PCR回收产物与克隆载体pMD18-T Vector 16℃连接10h，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，在氨苄抗性平板上进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆接种到LB液体培养基(氨苄青霉素50μg/ml），37℃摇床振摇(180r/min）培养6h至对数生长期，菌落PCR鉴定阳性克隆子。按质粒小量提取试剂盒说明提取质粒，质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.7 测定、分析18S rRNA基因序列 将阳性克隆送三博远志有限公司测序，所得18S rRNA基因序列进行BLAST分析(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增结果 琼脂糖凝胶电泳显示，扩增得到一条约1800bp的条带，与预期相符，表明成功扩增目的基因18S rRNA(图1）。

图1 18S rRNA基因克隆电泳图

图2 菌液PCR鉴定

2.2 PCR法筛选菌落阳性克隆 以筛选得到的阳性克隆菌液为模板，经PCR扩增出18S rRNA基因片段，与理论值一致，约1800bp，表明阳性克隆含有18S rRNA基因(图2）。

2.3 目的基因克隆后酶切鉴定 重组质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，预期产生大小分别约为2700bp和1800bp的两条带，电泳结果与预期相符，表明目的基因克隆成功(图3）。

图3 酶切鉴定重组质粒pMD18-T-18S rRNA

2.4 18S rRNA基因序列测定及分析 将所测18S rRNA碱基序列对NCBI数据库进行BLAST，河南省猪旋毛虫与毛线虫属的同源性最高，与已知虫株Trichinella nativa(AY487254.1)的同源性可达99%。

3 讨论

在旋毛虫的不同发育阶段，虫体各阶段之间及各地旋毛虫隔离种之间缺乏一定的规律性变化，因此旋毛虫形态学指标在分类研究中缺乏一定的说服力[4]。近年来同工酶分析、随机扩增多态性DNA(RAPD）及扩增片段长度多态性(AFLP）等多种方法应用于旋毛虫的鉴定与分类，但因需要大量虫体或重复性较差等因素使它们的应用受到了限制。

18S rRNA基因在生物体内含量较大，在进化过程中非常保守，核苷酸的替换率较低，在分类学中可作为一个科学可靠的指标。近年来，利用18S rRNA序列变化来探讨生物种间和种内的亲缘关系，系统进化以及鉴定未知的种属等问题，已经成为一种趋势[5]。李冬梅等[6]用 18S rRNA序列设计引物，应用PCR方法确定黑龙江株猪旋毛虫为旋毛形线虫，犬旋毛虫为本地毛形线虫。

本研究18S rRNA基因测序结果及同源性序列分析发现，河南猪旋毛虫与北方旋毛虫的同源性可达99%，表明河南省猪旋毛虫归属于T2(T.nativa）。但当前的研究发现，我国的猪源旋毛虫大多归属于T1，犬旋毛虫则多为T2。La Rosa等[7]对我国5个猪源旋毛虫地理株进行等位基因酶分析，发现均为T1；崔晶等[8]应用多重PCR技术鉴定，表明我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1。本研究的鉴定工作丰富了人们对我国猪源旋毛虫生物多样性的认识。

随着分子生物学的兴起和发展，研究者们选用众多的分子标记物应用于物种的系统演化和分类研究，在选用不同的遗传标记对物种进行分类的过程中，经常得出一些与传统分类学不相符的结果，甚至截然不同的结果[9]。我国地域辽阔，不同或者相同的地理区域旋毛虫种在遗传物质上既有保守性又有一定的分化。虽然旋毛虫的分类日益清晰，但物种在不断进化及变异，还须对一些种属的分类进行重新评定，做进一步的探索。我国是否还存在旋毛虫的其它种或基因型，还有待于对更多的旋毛虫地理株进行鉴定和分类。

[1]王中全，崔晶.旋毛虫病的诊断与治疗[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2008，26(1)：55-57.

[2]温艳，张月清.聚合酶链反应技术检测旋毛虫DNA的实验研究[J].中国人兽共患病杂志，2001，17(1)：61-62.

[3]姚春雨，汪明，刘明远，等.旋毛形线虫分类的研究进展[J].中国兽医科学，2008，38(01)：82-85.

[4]徐克成，刘明远，姚春雨.中国八地区旋毛虫繁殖力指数测定的比较[J].中国人兽共患病杂志，1998，14(3)：62-63.

[5]王宝庆，葛菁萍，平文祥.18S rRNA在系统进化研究中的应用[J].黑龙江医药，2005，18(4)：251-252.

[6]冬梅，王秀荣，路义鑫，等.4个旋毛虫隔离种18S rRNA基因分子克隆及序列比较分析[J].中国农业科学，2005，39(4)：860-864.

[7]La Rosa G, Pozio E, Rossi P, et a1.Allozyme analysis of Trichinella isolates from various host species and geographical regions[J]. J Parasitol, 1992, 78(4): 641-646.

[8]崔晶，赵桂花，王中全，等.应用多重PCR技术鉴定我国6个旋毛虫地理株的研究[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2008，26(2)：86-89.

[9]任竹梅，马恩波，郭亚平.山稻蝗及相关物种Cyt b基因序列及其遗传关系[J].遗传学报，2002，29(6)：507-513.

（基础医学栏目编辑:陈志宏）

MOLECULAR IDENTIFICATION OF SWINE-ORIGINATED TRICHINELLA IN HENAN PROVINCE

WANG Li-na, LU Guo-bing, YANG Xiao-dong, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To identify and classify swine-originated Trichinella in Henan province at molecular level by sequence homology analysis of 18S rRNA gene.Methods:Total RNA was extracted from adult Trichinella and obtained cDNA by reverse transcription. 18S rRNA gene was amplified by specific primer, connected to pMD18-T and transformed colibacillus competent cells. The positive clone was determined sequence and analyzed after restrictive endonuclease digestion.Results:In the phylogenetic tree, swine-originated Trichinella in Henan province had close relationship with Trichinella nativa (AY487254.1) of 99% sequences similarity.Conclusions:Swine-originated Trichinella in Henan province belongs to T.nativa.

Trichinella; Identification; 18S rRNA; Phylogenetic tree

图分类号】R383.1

A

1004-6879(2011）02-0128-03

2010-12-12）

△ 通讯作者