Bt野生菌Q1杀虫晶体蛋白及基因型分析

李先军，李 强，杜 超，王树艳

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院）

Bt野生菌Q1杀虫晶体蛋白及基因型分析

李先军1，李 强1，杜 超1，王树艳2

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院）

目的:分析我国千山地区森林地带土壤中分离的野生菌Q1的32类杀虫晶体蛋白基因类型和表达蛋白。方法:利用PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE蛋白分析方法，以JM110为受体菌、PMD-18T为克隆载体对cry7基因的同源区段进行克隆测序。结果:Q1同时含有cry1、cry7、cry16基因，同时表达了130kD、90kD和60kD蛋白。电镜观察显示晶体形状多为菱形或长菱形。测序后与模式基因比对相似性均在89%以上。结论:该实验为克隆cry7全长基因奠定了研究基础，丰富了菌株及基因资源，在资源积累方面具有重要意义。

苏云金芽孢杆菌；杀虫晶体蛋白；cry基因；RCR-RFLP

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前害虫生物防治、植物抗虫育种中研究较为深入，应用较为广泛，经济效益、生态效益和社会效益较明显的一类微生物。研究表明，Bt菌株的杀虫活性与其携带的编码ICP的cry基因密切相关，其杀虫活性范围已从鳞翅目扩大到双翅目、鞘翅目、直翅目和膜翅目等9个目的昆虫。由于对人畜无害，不污染环境，是目前世界各国害虫防治的重要手段之一，已广泛应用于农、林、卫生害虫的生物防治。因此，筛选高效、广谱、新型Bt杀虫菌株，以及发现新杀虫毒素蛋白基因均有着十分重要的理论意义和实践价值[1]。1996年Cuo和Chak将PCR-RFLP(又称CAPS)新技术应用于Bt cryl类基因的鉴定；1997年宋福平等在国内建立了cry2-cry11等Bt常见基因类型的CAPS鉴定体系[2]。目前PCR-RFLP技术已经被国内外许多学者用于Bt菌株cry基因鉴定和杀虫活性预测，且该体系鉴定范围已扩大到cry2-cry40型基因。本研究应用PCRRFLP技术，对我国千山地区不同森林地带土壤中分离的野生菌株Q1 cry基因型进行了分析，同时研究了各基因编码的晶体蛋白的表达。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及分离 从我国千山地区自然保护区森林地带土壤中分离得到野生菌Q1，采用醋酸钠选择性筛选法和抗生素选择性筛选法。

1.2 质粒提取及电泳 参照文献[3]提取Bt质粒DNA，0.7%琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，4V/cm电泳6h。

1.3 PCR-RFLP分析 分别用27对引物鉴定Bt菌株的32类基因型[1-5]。

1.4 杀虫晶体蛋白SDS-PAGE分析 参照萨姆布鲁克等的《分子克隆实验指南》操作[4]。

1.5 杀虫晶体蛋白透射电镜观察 释放晶体的Bt样品从培养基上刮下，灭菌水洗2次，4%戊二醛(0.025mol/ L磷酸缓冲液，pH7.0）和1%锇酸(相同缓冲液)固定，Epon812包埋，LKB-V超薄切片机金刚刀超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅各染色5min，Hitachi S-4100透射电镜观察并摄片。

1.6 cry7基因同源区段的PCR和克隆 以Q1菌株质粒DNA为模板，利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。回收PCR产物，与pMD18-T进行连接并转化大肠杆菌JM109，蓝白斑筛选阳性克隆，再进行PCR和限制性酶切鉴定[6]。

1.7 同源区段测序 由上海生工生物工程技术公司完成。

2 结果与分析

2.1 Bt菌株cry基因型鉴定 采用PCR-RFLP方法，对野生菌Q1进行了杀虫晶体蛋白cry基因型鉴定，结果见表1，图1-2。表明，1号菌株同时含有cry1、cry7、cry16类基因。

表1 苏云金芽孢杆菌基因型鉴定结果

图1 Q1菌株部分cry型基因PCR扩增产物图谱

图2 Q1菌株cry型基因RFLP鉴定图谱

2.2 杀虫晶体蛋白SDS-PAGE分析 结果见表1、图3。野生菌Q1表达130kD，90kD，60kD的蛋白。文献表明，大部分cry1型基因表达130kD蛋白，cry2型基因表达60kD蛋白；基因型鉴定结果野生菌Q1并不含有cry2型基因，加之90kD的蛋白比较少见，推测野生菌Q1可能含有其它类型的cry基因。

图3 Q1菌株晶体蛋白SDS-PAGE分析图谱

2.3 杀虫晶体蛋白透射电镜分析 见图4。透射电镜结果显示野生菌Q1的ICPs蛋白晶体形状呈菱形(E）或长菱形(B)，D为菱形棱角被消化的现象。

图4 Q1菌株晶体蛋白形态

2.4 cry7同源区段的克隆 野生菌Q1 cry7同源区段840bp的PCR高保真产物连接T载体后，转入E.coli JM110，克隆并测序。阳性克隆质粒鉴定图谱见图5，显示840bp的目的片断已被成功连接、克隆。与相关模式基因的相似性见表2。可确认为是新型cry7基因，全长基因在进一步克隆当中。

图5 cry7阳性克隆质粒单酶切检测图谱和PCR产物图谱

表2 新基因与模式基因的同源性比较

3 讨论

Bt菌株中杀虫晶体蛋白的表达与相应基因的存在有着一定的对应关系，一般cry1型基因表达130kD蛋白，cry2型基因达60kDa蛋白。但也存在个别现象，Q1菌株虽表达130kD、60kD的蛋白，从基因鉴定和蛋白分析结果可见，Q1菌株只鉴定出cry1型基因并不含有cry2型基因；cry7的同源区段已被克隆，可确认为是新型cry7基因，全长基因在进一步克隆当中[7-8]。

透射电镜可以清晰显现晶体形状，是一种研究晶体形状的可靠方法。研究发现，野生菌Q1的ICPs蛋白晶体形状呈现长菱形或菱形；且有些照片显示不规则的菱形晶体，可能是由于晶体被蛋白酶少量降解，棱角被钝化和切片位置不同造成。

[2]李长友.我国不同森林立地带Bt分离株杀虫晶体蛋白及基因分析[J].林业科学，2002，38(3)：102-105.

[3]Cherif A,Rezgui W,Raddadi N,et al.Characterization and partial purification of entomocin 110,a newly identified bacteriocin from Bacillus thuringiensis subsp.Entomocidus HD110[J]. Microbiol Res,2008.163(6):684-692.

[4]萨姆布鲁克.E.F，弗里奇 T.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，1992.304.

[5]Sauka DH,Cozzi JG,Benintende GB. Detection and identification of cry1I genes in Bacillus thuringiensis using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis [J]. Curr Microbiol,2006,52(1):60-63.

[6]Gaviria Rivera AM,Priest FG.Molecular typing of Bacillus thuringiensis serovars by RAPD-PCR [J].Syst Appl Microbiol, 2003,26(2):254-261.

[7]Sauka DH, Cozzi JG, Benintende GB. Screening of cry2 genes in Bacillus thuringiensis isolates from Argentina [J].Antonie Van Leeuwenhoek,2005,88(2):163-165.

[8]Juárez-Pérez V,Porcar M,Orduz S,et al.Cry29A and Cry30A: two novel delta-endotoxins isolated from Bacillus thuringiensis serovar Medellin [J].Syst Appl Microbiol,2003,26(4):502-504.

ANALYSIS OF INSECTICIDAL CRYSTAL PROTEIN AND ITS CRY-TYPE GENES OF BACILLUS THURINGIENSIS

LI Xian-jun, LI Qiang, DU Chao, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To analyze the gene type and expressed proteins of 32 kinds insecticidal crystal protein in Bacillus thuringiensis wild strain Q1 isolated from forest soil of Qianshan area.Methods:PCR-RFLP identification systemand SDS-PAGE protein analytical method were used in this study. The homologous sequence of cry7 gene was cloned and sequenced taken JM110 as recipient bacterium and PMD-18T as cloning vector.Results:Q1 contained three cry-type genes: cry1, cry7 and cry16, and encoded 130,90,60 kD protein at the same time. The electron microscope showed rhombus shape crystal. Compared with model gene, cry7 homologous sequence homology was more than 89%.Conclusions:This research enriches strains and genetic resources, and has important significance in accumulation of resources.

Bacillus thuringiensis; Insecticidal crystal protein; Cry gene; PCR-RFLP

Q785

A

1004-6879(2011）02-0124-03

2010-12-17）