糖尿病大鼠肾脏VEGF表达的变化及丝胶的保护作用

杨振军，宋成军，陈志宏

（承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000）

糖尿病大鼠肾脏VEGF表达的变化及丝胶的保护作用

杨振军，宋成军，陈志宏

（承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000）

目的:观察糖尿病大鼠肾脏血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白表达的变化及丝胶的保护作用。方法:48只雄性SD大鼠随机分为4组(每组12只）：正常对照组、糖尿病模型组、丝胶治疗组和丝胶预防组。分别采用免疫组化染色和Western Blotting法观察肾脏VEGF蛋白的表达。结果:与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠肾脏VEGF蛋白的表达明显升高(P＜0.01）；丝胶治疗组、丝胶预防组大鼠肾脏VEGF蛋白的表达明显低于模型组(P＜0.01）。结论:丝胶可通过下调肾脏VEGF蛋白的表达发挥对糖尿病大鼠肾脏损伤的保护和预防保护作用。

丝胶；糖尿病；肾脏；VEGF

1 材料与方法

1.1 实验分组 清洁级雄性SD大鼠48只，购自河北医科大学实验动物中心(合格证号：712024）。大鼠随机分为4组：正常对照组、模型组、丝胶治疗组和丝胶预防组，每组12只。模型组、丝胶治疗组和丝胶预防组大鼠均采用2% STZ(25mg/kg，3d）连续腹腔注射建立糖尿病动物模型，一周后以血糖≥16.7mmol/L作为成模标准。待模型成功建立后，模型组大鼠不再作任何处理；丝胶治疗组大鼠给予丝胶(2.4g/kg/d）灌胃，连续35天；丝胶预防组大鼠于注射STZ前给予同等剂量丝胶灌胃35天。

1.2 药物与试剂 STZ购于美国Sigma公司，临用时用PH4.4的枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液配成2%的溶液。丝胶由彩色蚕茧经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成，彩色蚕茧由承德医学院蚕业研究所提供。血糖检测试剂盒，保定长城临床试剂有限公司；鼠抗VEGF抗体，美国Santa公司(购自北京中杉金桥生物技术有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒，北京泰格美科技有限公司。

1.3 检测血糖 各组大鼠禁食12h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，经内眦于眶后静脉丛采血，3000r/min离心20min，收集血清，采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。

1.4 肾脏VEGF蛋白表达的检测 各组大鼠取血后断头处死，迅速取双侧肾脏，一侧肾脏投入液氮中冷冻，后移入-80℃冰箱保存，用于Western Blotting检测；另一侧肾脏入Bouins液固定，用于免疫组化染色。

1.4.1 免疫组化染色及定量分析：入Bouins液固定肾脏，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5μm。采用免疫组织化学染色法观察肾脏VEGF蛋白的表达。一抗为鼠抗，稀释浓度1：50，DAB显色，苏木素复染。以PBS代替一抗作为阴性对照，以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性反应。采用MiVnt图像分析系统对免疫组化染色阳性结果进行定量分析：VEGF阳性切片在高倍显微镜下(×400）选取视野，计算阳性产物面积占视野面积的百分比。每只动物任选3张切片，每张切片选取3个视野，取平均值。

1.4.2 Western Blotting检测及定量分析：取200mg肾脏组织，提取蛋白，BCA蛋白试剂盒定量蛋白浓度。采用Western Blotting方法检测大鼠肾脏组织VEGF蛋白的表达，蛋白上样量为60μg。12% SDS-PAGE凝胶电泳、转膜；一抗稀释浓度为1：200，4℃过夜；Super ECL Plus超敏发光液显影。采用Quantiy One软件对显影条带进行分析，以VEGF条带与β-actin条带的灰度比值作为VEGF蛋白的相对表达水平。

1.5 统计学处理 应用SPSS 12.0统计学软件处理数据，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 大鼠血糖 与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠的血糖明显升高(P＜0.01）。丝胶治疗组、丝胶预防组大鼠的血糖明显低于模型组(P＜0.01）。见附表。

2.2 肾脏VEGF蛋白的表达 免疫组化染色：VEGF蛋白阳性产物位于肾小球细胞胞浆，呈棕黄色细腻颗粒状，定量分析结果见附表；Western Blotting结果：见附表。模型大鼠肾脏VEGF蛋白的表达明显高于正常对照组大鼠(P＜0.01）；丝胶治疗组、丝胶预防组大鼠肾脏VEGF蛋白的表达明显低于模型大鼠(P＜0.01）。

附表 各组大鼠血糖和肾脏VEGF蛋白的表达（±s，n=12）

附表 各组大鼠血糖和肾脏VEGF蛋白的表达（±s，n=12）

与正常组比较:*P＜0.01，与模型组比较:＃P＜0.01

组别 血糖(mmol/L) VEGF免疫组化 Western Blotting正常对照组 10.83±2.03 0.0313±0.0079 0.651±0.095模型组 29.45±4.82* 0.0425±0.0076* 0.863±0.091*丝胶治疗组 13.20±4.09＃ 0.0314±0.0062＃ 0.653±0.074＃丝胶预防组 11.04±2.29＃ 0.0317±0.0082＃ 0.660±0.098＃

3 讨论

VEGF又称血管通透因子，在肾脏主要由足突细胞产生。DM时，AGEs增多、PKC活化、各种细胞因子的增加和肾素-血管紧张素系统的激活均可上调肾脏VEGF的表达[4]。在DN早期，肾组织VEGF的表达即增加，并且VEGF可能通过自分泌或旁分泌方式增加肾小球毛细血管的通透性，导致DN早期蛋白尿的产生；在DN中晚期，VEGF可能通过某些信号转导通路介导，与其它细胞因子共同促使蛋白尿形成；另外，VEGF还可特异作用于血管内皮细胞，通过增加微小静脉的通透性导致蛋白尿的产生[5-6]。大量的蛋白尿反过来可通过多种途径引发肾小球进行性硬化和肾间质纤维化，从而使DN进一步发展和恶化，导致终末期肾病的发生。此外，VEGF还可能通过诱发FN等细胞外基质的沉积，促使肾小球硬化、肾小管基底膜增厚和肾间质纤维化，从而在DM肾脏肥大及硬化中发挥重要作用[6]。

目前治疗糖尿病多采用一些化学合成的药物(如二甲双胍、西他列汀、拜糖平等），虽然疗效可靠但副作用较大。即使是公认的经典首选药物—双胍类，在降糖的同时，易引起乳酸性酸中毒，死亡率较高[7]。丝胶是蚕丝中包被在丝素外围的高分子水溶性蛋白，约占茧丝的30%，主要由18种氨基酸组成，以往对蚕丝的研究主要集中在丝素，丝胶多作为废料遗弃，如此大量优质蛋白质的有效利用一直是蚕丝界迫切希望的。

本研究发现，丝胶治疗组、丝胶预防组大鼠肾脏VEGF蛋白的表达明显低于模型组。表明，丝胶可通过下调VEGF的表达，改善DN时肾小球毛细血管的通透性、缓解基膜增厚，减轻细胞外基质的沉积，延缓DN的发展；同时，丝胶预处理可阻止DN时VEGF的高表达，从而防止DN时肾小球毛细血管通透性的改变和细胞外基质沉积。并且，由于丝胶是天然的蛋白质，具有生物相容性，可生物降解，对人体无毒性[8]，避免了化学合成药物带给人体的副作用，因此具有良好的应用推广前景。

[1]Futrakul N,Butthep P,Futrakul P,et al.Improvement of renal function in type 2 diabetic nephropathy[J].Ren Fail,2007,29(2): 155-158.

[2]Rossert J, Froissart M, Jacquot C.Anemia management and chronic renal failure progression[J].Kidney Int Suppl, 2005, (99):S76-81.

[3]Bates DO,Harper SJ.Regulation of vascular permeability by vascular endothelial growth factors [J].Vascular Pharmacol, 2002,39(45):225-237.

[4]崔静，李竞，王蜀鄂.色素上皮衍生因子和血管内皮生长因子在糖尿病大鼠肾脏的不平衡表达[J].中国微循环，2008，12(3)：155-157.

[5]罗圣平，龙梅芳.葛根素注射液对糖尿病肾小球VEGF表达调节的实验研究[J].中国中医急症，2008，17(5)：658-661.

[6]周青，王冬芽，郭兵，等.糖尿病大鼠肾组织VEGF和TGF-β1的动态表达及意义[J].江西医药，2008，43(1)：13-16.

[7]Gambaro V,Dell’acqua L,Farè F,et al.A case of fatal intoxication from metformin[J].J Forensic Sci, 2007,52(4):988-991.

[8]张海萍，朱良均，胡虹.丝胶蛋白固定化L-天冬酰胺酶的特性研究[J].蚕桑通报，2003，34(1)：16-19.

CHANGES OF VEGF EXPRESSION IN KIDNEY OF DM RATS AND PROTECTIVE EFFECTS OF SERICINE

YANG Zhen-jun, SONG Cheng-jun, CHEN Zhi-hong
(Department of Human Anatomy, Chengde Medical College, Chengde 067000, China)

Objective:To observe the changes of vascular endothelial growth factor (VEGF) in kidney of diabetes mellitus (DM) rats and protective effects of sericine.Methods:48 male SD rats were randomly divided into 4 groups (n=12): normal control group, DM model group, sericine treatment group and sericine prevention group. Immunohistochemical staining and Western Blotting were respectively used to observe the expression of VEGF protein in kidney.Results:Compared with normal control rats, the VEGF expression in kidney of rats in model group increased obviously(P＜0.01). VEGF expression in kidney of rats in sericine treatment group and sericine prevention group were significantly lower than that of model group(P＜0.01).Conclusions:Sericine has protective and preventive effects on kidney injury of DM rats by down regulating VEGF expression.

Sericine; Diabetes mellitus; Kidney; VEGF糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN）是糖尿病(diabetes mellitus，DM）常见的严重微血管并发症，是引起慢性肾功能不全进而导致透析治疗或肾脏移植的重要原因之一[1-2]。DN的发病机制目前仍不十分清楚，长期高血糖是DN发生的最关键原因，毛细血管功能改变和新生血管形成是DN的重要病理特征。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种有效的血管形成和血管通透性诱导因子，属于促血管生长因子[3]。有研究表明，VEGF在DN的发生发展过程中发挥重要作用。本研究采用链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ）致糖尿病大鼠模型，观察丝胶对糖尿病大鼠肾脏VEGF表达的作用，探讨丝胶对DM大鼠肾脏的保护作用及机制。

R587.2

A

1004-6879(2011）02-0119-03

2010-09-28）