粒细胞集落刺激因子在大肠杆菌中表达的研究进展*

何 磊，于凤波，王永峰，杭太俊

(1.中国药科大学，南京 210009； 2.天津天士力研究院，天津 300410)

1 粒细胞集落刺激因子概述

粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factors, G-CSF)是存在于正常人体、刺激骨髓细胞集落形成的集落刺激因子的一种，能够在体内外特异地作用于中性粒细胞系,促进其增殖、分化,并能维持功能和存活的一种糖蛋白类生长因子[1]。

早在1986年,由Nagata等从人鳞状细胞癌细胞系CHU-II中分离了hG-CSF基因,首次确定了其核苷酸序列并在COS细胞中表达。hG-CSF是一种单核细胞、成纤维细胞及内皮细胞产生的由174个氨基酸残基组成的含30种信号肽的糖蛋白,分子量为19. 6 kDa，PI为6.1，O-糖基化对酸碱(pH 2～10)、热以及变性剂等相对较稳定。hG-CSF有5个半胱氨酸残基,其中4个半胱氨酸残基在Cys 36与Cys 42, Cys 74与Cys 64之间形成两对二硫键;Cys 17为不配对半胱氨酸,二硫键对于维持G-CSF生物学功能是必须的因素[2]。

2 粒细胞集落刺激因子临床应用

G-CSF在临床上应用十分广泛，骨髓移植时可促进中性白细胞的恢复；改善再生障碍性贫血伴随的中性白细胞缺乏症；明显改善癌症化疗时引起的严重的中性粒细胞缺乏,加大肿瘤治疗的力度,增强治疗效果；广泛应用于其他伴有中性粒细胞减少的疾病及抗感染等的治疗。G-CSF天然产物来源非常有限,远远不能满足临床上的需要。而基因工程的重组G-CSF的生物学活性与天然的相似，且可大规模生产,利用DNA重组技术生产可供临床应用的人重组G-CSF的方法已被广泛应用[3，4]。

3 粒细胞集落刺激因子在大肠杆菌中的表达研究

早在1985年,Welte K成功地从人膀胱癌细胞株5637的培养上清液中纯化并精制出hG-CSF,然后Welte K与美国的AMGEN公司的Souza L M又进一步确定这种hG-CSF的N段氨基酸排列顺序,将来源于5637细胞株的hG-CSF基因克隆化,采用基因工程技术将该基因插入大肠杆菌成功地制得hG-CSF而开发出重组人粒细胞集落刺激rhG-CSF,商品名为Filgratin(惠尔血)。该药1991年美国FDA批准上市[5]。

我国科研工作者也成功构建多个重组G-CSF工程菌种,利用原核表达体系实现高表达。葛永红等[6]采用RT-PCR技术从LPS诱导的人外周血单核细胞中扩增出人粒细胞集落刺激因子cDNA,将编码成熟序列的cDNA在保证编码氨基酸不变前提下突变并插入到PR启动子下游,使rhG-CSF在大肠杆菌中获得表达。表达产物为包涵体,占菌体总蛋白量的21.4%。2008年,傅一鸣等采用PCR方法,成功构建了C末端融合有一种能特异结合人抗体Fc段的小肽的新型rhG-CSF融合蛋白(rhG-CSF-tag1)表达载体,实现了其在大肠杆菌中的高效表达、复性和纯化。亦有人采用优化密码子的方法成功实现了高表达,以及进行修饰cDNA 序列后提高表达的成功先例[7-8]。目前已有长效PEG化的rhG-CSF成功的报道。张兵等[9]经大肠杆菌温度诱导表达得到包涵体,经过变性、复性和分离纯化等步骤处理后得到纯化的rhG-CSF。用单甲氧基聚乙二醇活性酯(mPEG20k-NHS)对rhG-CSF进行化学修饰,尽管修饰后的rhG-CSF体外生物学活性下降至修饰前的20%左右,但其在体内的作用时间能够得到显著的延长,药效有了明显提高。

从制备工艺和G-CSF的构效关系角度考虑,采用原核表达体系(主要是大肠杆菌表达体系)具有遗传背景清楚、细胞生长迅速、发酵周期短、易于筛选和基因重组操作、表达系统较为丰富等优点。但是原核表达体系也存在一些缺点，如外源蛋白无法糖基化和易于形成包涵体等。G-CSF具有糖基化与否并不影响其活性的特点,而外源蛋白形成的包涵体必须经过变性、再折叠复性,才能得到活性蛋白产物。但上述表达G-CSF方法都形成包涵体,必然存在操作过程烦琐、复性效率低等问题。原核表达体系如能够实现外源蛋白的胞内可溶表达或周质腔分泌表达,在实践应用中将会大大提高工作效率,节约生产成本[10]。

人们曾采取多种方式促进外源蛋白的可溶表达。与葡萄球菌蛋白A (SPA)[11]、谷胱甘肽(GST)[12]或硫氧环蛋白(thioredoxin)[13]融合表达,对部分外源蛋白能够起到促可溶作用；利用蛋白质二硫键形成相关蛋白[14,15]、脯氨酰顺反异构酶[16]和其他分子伴侣的辅助折叠作用,设计表达载体,能够明显促进外源蛋白的胞内可溶表达。但是,胞内可溶表达方式也具有比较明显的缺点，如胞内属还原性环境,不利于外源蛋白形成正确的二硫键桥,进而影响正确构像的形成[17]；需要超声破碎或压力破碎细胞壁才能释放胞内可溶表达组分,不利于大规模培养和纯化。

比较而言,因为周质腔属氧化型环境[17], 可以模拟真核细胞的内质网环境,有利于形成正确的二硫键桥,获得具有完全生物学活性的重组蛋白，而且提取周质腔表达组分时不需要破碎细胞壁,能够大幅度降低纯化成本,所以周质腔分泌型表达是一种理想的表达方式[17]。

通常将外源蛋白与适当的信号肽融合,借助信号肽的引导作用将外源蛋白分泌到周质腔中。在所有分泌到大肠杆菌周质中的蛋白质中均发现了信号序列,信号序列对于在大肠杆菌中分泌蛋白质是必要的。利用大肠杆菌系统,在外源基因的N端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽(OmpA、OmpF、PeIB、PhoA、SpA等，就其本身或有稍微的修饰),可将目的蛋白运送到周质空间(translocation)。蛋白跨内膜后由细菌的信号肽酶将信号肽切除,获得具有天然一级结构(不含N端多余的甲硫氨酸)的产物。控制表达载体的拷贝数,选择合适的启动子和培养基,采用适当诱导表达方式和培养条件(培养温度、诱导时机和诱导时间),会改善周质腔分泌型表达的效率[18]。Perez-Perez等[19]尝试得到分泌形式的hG-CSF,使用大肠杆菌信号序列之一的OmpA,没有成功。但为了解决该问题,他们使用两种分子侣伴蛋白DnaK和DnaJ的共表达系统,仅仅得到少量分泌的hG-CSF。另外,Chung等[20]用另一种信号序列Pe1B试图得到分泌形式的hG-CSF,同样没有成功,但hG-CSF以不溶性包涵体的形式在胞质中积累。王富强等[21]构建了含有金黄色葡萄球菌蛋白A的信号肽序列的hG-CSF基因,导入到大肠杆菌融合分泌表达载体pSEGF中,将hG-CSF融合蛋白直接分泌到培养基中。虽表达产物具有很好的可溶性,不会聚集形成包涵体,但和胞内表达相比,表达量较低仍然是该技术的问题。1998年,金磊[22]在构建重组质粒时加入信号肽和Trp启动子,导入大肠杆菌K12菌种中,控制发酵温度,得到分泌蛋白,收率达35%左右。

大肠杆菌分泌蛋白二硫键的形成是一系列蛋白协同作用的结果,主要是Dsb家族蛋白,迄今为止共发现了DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、DsbE和DsbG。在体内,DsbA负责氧化两个巯基形成二硫键,DsbC和DsbG则负责校正DsbA导入的异常二硫键。除了直接和二硫键的形成相关外,DsbA、DsbC和DsbG都有分子伴侣功能。该分子伴侣功能独立于二硫键形成酶的活性并且对二硫键形成酶活性具有明显的促进作用。

Carlos等[23]运用λPL启动子,在其他实验条件，如培养基的组成、诱导时机、表达条件、宿主细胞(大肠杆菌W3110或RB791)等相同的情况下, 利用DsbA、npr、STII，以及一种从天然生长激素中提取的信号蛋白序列(作为对照)等4种不同的信号肽,将目的蛋白分泌到大肠杆菌周质腔，通过研究发现,以DsbA作为信号肽序列的重组hGH基因在大肠杆菌W3110或RB791周质腔中得到了最高的表达量,分泌表达蛋白占总蛋白的80%。利用DsbA蛋白作为信号肽,在实现G-CSF突变体周间腔水平的分泌表达,得到活性蛋白的生产工艺将会得到长足的发展。

1 Nafar M,Parvin M,Sadeghi P,etal.Effects of stem cells and granulocyte colony stimulating factor in reperfusion injury.Iran J Kidney Dis,2010,4(3):207

2 Hill C P,Osslund T D,Eisenberg D.The structure of granulocyte-colony-stimulating factor and its relationship to other growth factors.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(11):5167

3 张学军,孔南迁.重组人粒细胞集落刺激因子在恶性肿瘤化疗后应用的疗效观察.中国药房,2010,21(8):713

4 龙女,张巧花,侯淑玲.重组人粒细胞集落刺激因子的临床应用现状. 中国药物与临床,2010,10(6):676

5 于景敏,孟志云,窦桂芳.粒细胞集落刺激因子的研究新进展. 中国实验血液学杂志, 2008,16(2):452

6 葛永红,储淳,刘国荣,等.重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)在大肠杆菌中的表达及鉴定.中国生物制品学杂志,1998,11(2):68

7 乌垠, 杨红,陆军,等. 重组人粒细胞集落刺激因子在Escherichia coli中的表达研究.东北师大学报(自然科学版),2000,32(04):46

8 Bo-Hye Nam,Geun-Hee An,Gun-Wook Baeck,etal.Molecular cloning and expression of cDNAs for two distinct granulocyte colony stimulating factor genes from black rockfish Sebastes schlegelii.Fish & Shellfish Immunology,2009,27(2):360

9 张兵,邹文艺,戎隆富,等. 重组人粒细胞集落刺激因子的表达、纯化以及PEG修饰. 生物学杂志,2008,25(2):36

10 罗惠霞,李敏,王玉炯.Reteplase(K)原核分泌表达载体的构建及其初步表达.生物学杂志,2010,27(5):7

11 李爱华,唐涛,张惠媛,等.细菌磁小体的修饰及其在病原物检测中的应用.生物物理学报,2010,26(8):680

12 蔡学敏,赵娜,左大明,等.人MASP1 N端片段原核表达载体的构建及其表达. 细胞与分子免疫学杂志, 2008,24(6):546

13 汪洋,马明浩,冯震,等.重组人谷氨酸脱羧酶65的表达及活性研究.中国生物工程杂志,2009,29(4):12

14 Yoichi Kurokawa,Hideki Yanagi, Takashi Yura,etal.Overexpression of protein disulfide isomerase DsbC stabilizes multiple-disulfide-bonded recombinant protein produced and transported to the periplasm in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol,2000,66(9):3960

15 Zhang Z,Huang H L.Escherichia coli disulfide-forming related proteins:structures,functions and their application in gene engineering for expressing heterologous proteins in Escherichia coli.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2002,18(3):261

16 彭金彪,韩宏晓,洪 炀,等.日本血吸虫 Sj CyclophilinA 基因的克隆、表达及其生物学功能研究.中国农业科学,2010,43(7):1531

17 王骊丽,耿信笃.源于大肠杆菌蛋白的表达、液相色谱复性与纯化新进展.中国科学,2009,39(8):711

18 Mergulhao F J,Monteiro G A,Larsson G,etal.Evaluation of inducible promoters on the secretion of a ZZ-proinsulin fusion protein in Escherichia coli.Biotechnol Appl Biochem,2003,38(1):87

19 Perez-Perez J,Martinez-Caja C,Barbero J L,etal.DnaK/DnaJ supplementation improves the periplasmic production of human granulocyte-colony stimulating factor in Escherichia coli.Biochem Biophys Res Commun,1995,210(2):524

20 Bong Hyun Chung,Mi-Jin Sohn,Su-Wan Oh,etal.Overproduction of human granulocyte-colony stimulating factor fused to the pelB signal peptide in Escherichia coli.Journal of Fermentation and Bioengineering, 1998,85(4):443

21 王富强,周兴军,王彦芳,等.hG-CSF大肠杆菌分泌表达系统的构建.Pharmaceutical Biotechnology,2001,8(5):260

22 金磊.粒细胞集落刺激因子的制备.中国专利: 98103011.4,1999-02-03

23 Carlos R J Soares,Fernanda I C Gomide,Eric K M Ueda,etal.Periplasmic expression of human growth hormone via plasmid vectors containing the λPLpromoter: use of HPLC for product quantification.Protein Engineering Design & Selection,2003,16(12):1131