5种水产动物血红细胞形态显微观察比较及进化分析

汪 青,包永波,林志华,刘浩明

(1.上海海洋大学 水产与生命学院,上海 201306; 2.浙江万里学院 生物与环境学院,浙江 宁波 315100)

血红细胞作为动物最重要的气体运输和气体交换的载体,是血液中含量最多的血细胞。从低等动物到高等动物,随着动物的生境由水生变为陆生、活动空间不断增大、活动剧烈程度不断增强,动物本身对氧气运输的需求不断增加以及动物血细胞逐渐分化使得动物的血红细胞红细胞发生着相应的变化。

关于各种动物的血细胞研究,前人做过一些报道。罗曼等[1]通过电镜对黄缘闭壳龟(Cuora flavomarginata)血细胞亚显微形态结构进行扫描和透射观察; 陈玉琴等[2]利用光镜和扫描电镜观察红腹锦鸡(Chrysolophus pictus)血细胞的形态特征; 曹伏君和刘楚吾[3]对花尾胡椒鲷(Plectorhinchus cinctus)进行光镜及扫描电镜观察,鉴定血细胞的种类、形态及功能; 潘鸿春[4]运用透射电镜研究虎纹蛙(Rana rugulosa)外周血细胞的超微结构; 张维翥等[5]通过光镜、扫描电镜和透射电镜观察对海湾扇贝(Argopecten irradians)血细胞的形态、表面结构和超微结构进行研究; 刘志鸿等[6]、潘莎芳等[7]分别对泥蚶(Tegillarca granosa)、毛蚶(Scapharca subcrenata)血细胞形态和抗菌作用进行了观察; 姜勇和雷朝亮[8]运用扫描电镜观察家蝇(Musca domestica)血细胞。然而对多种不同生物进行血红细胞的比较研究,从进化角度方面开展的血细胞研究则相对较少,Hartman和Lessler[9]在光镜下观察和测量8种鱼类动物、5种两栖类动物、33种爬行类动物红细胞的大小,分析红细胞大小变化的规律; Bhattacharyya等[10]利用原子力显微镜和横向力显微镜,观察并分析人、家鸡、树蜥、蟾蜍、鱼红细胞表面超微结构特征。然而对于脊椎动物和无脊椎动物,尤其是贝类动物中具有红色血液的蚶科贝类的红细胞的比较分析,目前尚未见文献报道。

本文旨在研究蚶科贝类血红细胞的形态特征和微观结构,及与其他水产动物血红细胞差异比较,以探究血红细胞形态进化特征。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用动物泥蚶、毛蚶、鲫鱼(Carassius auratus)、牛蛙(Rana catesbeiana)、中华鳖(Pelodiscus sinensis)均购自宁波钟公庙菜市场,体质健康。

1.2 主要实验试剂与仪器

Hemacolor染液(默克,德国),2.5%的戊二醛(pH 7.2),日立-3400N扫描电镜,Olympus BX-51显微镜。

1.3 光镜及电镜样品制备

血液采集及制作血涂片：泥蚶、毛蚶用开壳器开壳,用一次性针管抽取外套膜中血窦内血液; 鲫鱼在尾部静脉吸取血液; 牛蛙采用双毁髓法,心脏取血; 中华鳖采用颈静脉抽血; 将采集的血液立即滴在载玻片的一侧,用干净的载玻片推片,制作血涂片。

细胞学染色及观察：用 Hemacolor染液染色,Olympus BX-51显微镜观察并拍照; 细胞形态参数用DT2000图像分析软件进行测量; 数据统计及显著性检验(ANOVA)用SPSS软件完成。

扫描电镜样品制备：用一次性针管吸取血液0.3mL,滴入 2.5%的戊二醛(pH 7.2)中进行固定; 样品固定后,进行样品处理及扫描电镜观察。

2 结果

2.1 光镜观察结果

泥蚶、毛蚶作为低等动物,其红细胞的外形与脊椎动物有较大的不同,细胞表面多有不规则透明区域,且蚶科动物细胞质内含有蓝紫色嗜碱性颗粒或褐色嗜酸性颗粒,或者两者兼有(图 1(1),(2); 表 1);而从鲫鱼开始,脊椎动物的红细胞表面变得光滑,细胞质均一,无颗粒(图1,表1)。

图1 采用光镜观察的5种水产动物血红细胞形态Fig.1 Observation of erythrocytes of five aquatic animals by light microscope

表1 5种水产动物血红细胞在光镜观察下的外形特征Tab.1 Morphological characteristics of erythrocytes of five aquatic animals by light microscope

在红细胞大小方面,蚶科贝类(泥蚶、毛蚶)大小相似,无明显差异; 鲫鱼血红细胞的大小与两种贝类并无明显差别; 牛蛙红细胞直径和长宽比更大;中华鳖红细胞的直径和长宽比则较牛蛙小; 同样,5种水产动物红细胞的细胞核直径、细胞核长宽比也呈现与红细胞直径变化相似的趋势(表2)。

2.2 扫描电镜观察

2种蚶科贝类在扫描电镜下结构相似,具有明显的波状皱褶(F)和凹陷(G),偶见有分泌小泡的存在(E); 泥蚶、毛蚶两种软体动物血红细胞表面的透明区域可能是由于该区域细胞较薄,染色较浅造成,扫描电镜观察到的表面凹陷可能就是该区域; 与光镜观察结果相似,脊椎动物血红细胞从最低等的鲫鱼开始,便与 2种贝类血红细胞的表面结构有显著不同：鲫鱼等 3种脊椎动物血红细胞表面波状褶皱已经消失; 可以见到较多的凹陷和隆起,但细胞表面隆起的程度和表面凹陷程度逐渐降低(图2,表3)。

表2 5种水产动物血红细胞光镜下的细胞大小Tab.2 Measurements of erythrocytes of five aquatic animals by light microscope

图2 采用扫描电镜观察的5种水产动物血红细胞形态Fig.2 Observation of erythrocytes of five aquatic animals by scanning electronic microscope

表3 5种水产动物血红细胞扫描电镜观察Tab.3 Observation of erythrocytes of five aquatic animals by scanning electronic microscope

3 讨论

3.1 蚶科贝类血红细胞形态分析

蚶科贝类作为少数具有红色血液的软体动物,其所拥有的血红蛋白在进化地位上的特殊性一直备受关注[11-14]。然而关于蚶科贝类所拥有的血红细胞的研究鲜有报道,尤其是从进化角度探讨蚶科动物血红细胞的特殊性的研究。关于蚶科贝类血红细胞与脊椎动物血红细胞的进化关系未见报道。本研究结果表明：蚶科动物血红细胞的形态特征与高等动物有较大差异,但符合血红细胞形态特征的变化规律。

毛蚶与泥蚶分类学上同属于蚶目蚶科,埋栖型贝类,分别埋居于泥沙和软泥底中,无水管,仅以壳后缘在滩涂表面形成水孔与外界相通。泥蚶和毛蚶分类学地位和生活习性的相似性可能导致了两种蚶科贝类血红细胞形态极为相似：两种蚶科贝类大小与形态相似,都具有嗜酸性或嗜碱性颗粒,表面都具有极为明显的褶皱和凹陷(图1(1),(2),图2(1),(2))。

泥蚶、毛蚶两种软体动物血红细胞细胞质内含有的嗜碱性和嗜酸性颗粒,有研究认为这些颗粒为溶酶体[6-7,15]; 而鲫鱼等3种脊椎动物血红细胞细胞质均一,无颗粒(图1)。这是由于蚶科贝类(如泥蚶、毛蚶等贝类)血细胞没有完全分化,免疫系统不完善,需要自身吞噬作用发挥抗菌作用[5-6,15-18]。周永灿和潘金培[19]认为在贝类中参与免疫的主效因子是血红细胞,由于贝类不具有特异性免疫,只有细胞和体液的非特异性免疫系统,因此,血红细胞对贝类免疫来说至关重要,它是贝类体内抵御外来病原生物侵袭的主要“屏障”。刘世良等[20]发现贝类血红细胞的功能与维持体内各种生理环境的稳定性有密切关系,血红细胞除具有营养、防御的功能,主要通过参与包埋,吞噬,结节形成,细胞凝块和伤口修复等过程起到免疫防御作用。这表明泥蚶、毛蚶等蚶科动物血红细胞与脊椎动物血液内的免疫细胞具有相似的功能,承担了部分免疫功能。

3.2 蚶科贝类与其他 3种水产脊椎动物血红细胞比较分析

随着生物进化,动物血细胞种类增多,功能逐渐分化,血红细胞专职于进行气体交换。研究推测,随着生物对氧气的供应需求逐渐增高,使得血红细胞以增加气体运输量和气体交换效率为基准不断进化,这甚至体现在红细胞的形态和表面结构上。

两种蚶类与鲫鱼在血红细胞大小上有较大差距,蚶类血红细胞圆厚,而鲫鱼则扁薄; 而与鲫鱼相比,牛蛙血红细胞更扁薄,血红细胞直径更长(表 1)。Hartman和 Lessler[9]认为相同体积情况下,椭圆形的血红细胞比球形血红细胞更加有利于交换气体。这说明从软体动物到两栖类动物血红细胞交换气体的功能逐渐增强。从软体动物到两栖类动物,生物活动空间及活动剧烈程度逐渐增加,由水生向陆生进化,由水中获氧转向空气中获氧,这使得生物发展了肺,逐渐增强生物气体交换的效率。红细胞也随着这一过程协同进化：由于氧气运输的效率低下,生物对氧气的需求越来越多,从软体动物到鱼类再到两栖类动物,动物血红细胞体积显著增大,并且使细胞变得椭圆和扁薄,以获得更大的气体交换效率。

一般来说,进化地位越高等的动物,红细胞越小,数量越多。这是因为红细胞体积的缩小会带来表面积的增加,起到提高呼吸机能的作用[9]。从两栖类到爬行类,血红细胞长宽比逐渐减小,体积逐渐减小,红细胞数量逐渐增多[9],使得红细胞比面积不断增大,因此血红细胞气体交换能力不断增强。推测从两栖类到爬行类再到哺乳类,动物活动的空间越来越大,活动也更加剧烈,对氧气的需求更大。这使得动物组织细胞需要更有效率的气体交换,于是生物体逐渐进化出毛细血管和体积更小、数量更多的血红细胞,从而极大地增大了生物体气体交换速率,更有利于生物的生存。血红细胞体积小巧,使得其在动物血液中流动更容易; 红细胞越小,动物产生红细胞的速度也会更快,这样可以加快红细胞的更新速率,更有利于动物的生存,逐渐为生物进化所保留。

血红细胞表面结构特征与生物的进化有密切的联系。泥蚶、毛蚶血红细胞表面皱褶与凹陷显著,而从鲫鱼开始,脊椎动物血红细胞的表面结构逐渐趋于光滑。我们推测虽然蚶类“红细胞”血红蛋白结合氧气能力较低[11-12],但是蚶类血红细胞的表面皱褶和凹陷非常明显,显著的表面皱褶和凹陷,增加了红细胞与外界的接触面积,使得红细胞内血红蛋白接触氧气的面积更大,让更多的血红蛋白与氧气结合,从而可以间接地增加了血红细胞对氧气的运载能力。Elgsaeter和Mikkelsen[21]认为血红细胞的细胞膜可以维持血红细胞的形状,并且可以防止由于血红细胞在通过毛细血管时变形而导致的细胞破碎的发生。研究推测血红细胞表面皱褶和凹陷太过剧烈可能会导致细胞结构的不稳定,而且生物逐渐发展了毛细血管,血红细胞通过较小空间的毛细血管时,可能会导致细胞的破裂,因此,细胞表面逐渐趋向于变得光滑。

综上可知,虽然蚶科动物血红细胞胞质内颗粒、整体形态和表面结构等与脊椎动物血红细胞差异较大,但仍然符合血红细胞的进化规律,即血红细胞功能逐步分化与完善; 外形逐渐趋向于体积小巧但比面积大的结构,血红细胞表面则趋于光滑,以获得最大的气体交换效率与细胞的稳定性。关于蚶科动物血红细胞与脊椎动物血红细胞进化上的关系,目前只是从形态上加以分析,下一步我们会从分子和蛋白水平对泥蚶血红细胞及血红蛋白进行更深入的研究,以期揭示泥蚶血红蛋白的分子和蛋白结构特征,分析其进化地位。

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