褐藻糖胶脱蛋白及脱色方法研究

陈淑华，张淑平，杜秀秀，周勤生

（上海理工大学，上海 200093）

褐藻糖胶又名岩藻多糖硫酸酯或岩藻聚糖，是一种含有硫酸酯的水溶性杂聚糖，是褐藻中特有的一种化学组分[1]。目前，已有研究报道指出，褐藻糖胶具有广泛的生理活性，如降血脂、抗凝血、抗氧化、免疫、抗肿瘤、抗疲劳等活性，成为目前海洋药物开发的热点。褐藻糖胶粗品含有一定量的蛋白质和色素，不但影响其品质，还会影响其生理活性及其他方面的进一步研究[2]。脱蛋白方法主要有酸法[3]、酶法[4]、有机试剂法[5]等，由于酶法成本较高，且酶灭活需要达到100℃，容易破坏多糖结构，不适于大量实验；碱法效率低，不易回收样品。因此，本实验采用酸法和有机试剂法进行实验，以寻求最佳的实验参数。脱色方法主要有物理吸附法，如离子交换树脂[6]、活性炭[7]，化学氧化法[8]等。由于树脂的前后期处理相对复杂，而活性炭脱色存在残渣难以除去的问题[9]，因此本实验采用过氧化氢氧化法脱色。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试 剂 供试试剂为硫酸、苯酚、乙醇（95%）、考马斯亮蓝G-250、葡萄糖、牛血清蛋白、三氯乙酸、正丁醇、氯仿、过氧化氢等，均为国产分析纯。

1.1.2 仪 器 FA2004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、HY31-01型电热恒温水浴锅（绍兴柯桥医疗器械厂）、UV-1600型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 脱蛋白 Sevag法[10]：氯仿与正丁醇体积比为5∶1，配置成Sevag试剂，褐藻糖胶溶液与Sevag试剂体积比为4∶1，磁力搅拌20min，于分液漏斗中静置30 min，弃去下层液，并移取一定量上层液测定其蛋白质含量和多糖含量，重复上述操作。

TCA法[11]：配制4mol/L TCA溶液备用。取7支具塞试管，先加入10mL褐藻糖胶溶液，分别取0.1，0.4，0.7，1.0，1.3，1.6，1.9 mL TCA 溶液加入上述试管中，置于冰箱保存过夜，然后将上述混合液离心，测定其蛋白质含量和多糖含量。

Sevag法与TCA法结合：在上述实验的基础上，将Sevag法与TCA法结合，确定最佳实验参数为，Sevag法2次，TCA溶液添加量为1.3 mL/10mL褐藻糖胶溶液。

1.2.2 脱 色 波长的选择：将待脱色的多糖溶液在250～550 nm处每隔一定波长测定其吸光度，确定最佳吸收波长。

脱色实验参数[8]：在单因素实验的基础上，确定最佳脱色实验参数为：过氧化氢添加量为8%，脱色温度为50℃，脱色时间为7 h。

先脱蛋白后脱色：选用1.2.1的最佳脱蛋白方法先将褐藻糖胶中蛋白质除去，再以单因素实验得到的最佳脱色参数进行脱色，计算脱色率。

未脱蛋白脱色：将褐藻糖胶溶液直接按照单因素实验得到的最佳参数进行脱色，计算脱色率。

1.2.3 测定指标 （1）总糖含量的测定：苯酚-硫酸法[12]。以葡萄糖绘制标准曲线，回归方程为y=37.829 x-0.013 4，r2=0.995 5。

式中：m1为去除蛋白质前原液中多糖的含量；m2为去除蛋白质后溶液中多糖的含量。

（2）蛋白质含量的测定：考马斯亮蓝G-250法[13]。以牛血清蛋白绘制标准曲线，回归方程为y=33.628 x+0.018 5，r2=0.997 0。

式中：n1为去除蛋白质前原液中蛋白质的含量；n2为去除蛋白质后溶液中蛋白质的含量。

（3）脱色率的计算：以蒸馏水为空白对照，测定溶液色度。

式中：p1为脱色前溶液的吸光度值；p2为脱色后溶液的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 脱蛋白

2.2.1 Sevag法脱蛋白 图1、2是采用传统Sevag法脱蛋白后蛋白质和多糖浓度的变化曲线图。由图可以看出，当第1次加入Sevag试剂时，蛋白质浓度和多糖浓度下降幅度较大，此时的脱蛋白率达到了39.21%，多糖损失率为33.36%。第2次加入Sevag试剂时的蛋白脱除率为50.54%，多糖损失率为39.77%。结合图1、2可以得出以下结论：Sevag法脱蛋白比较剧烈，效果较好，但同时多糖的损失率较大，当第5次加入Sevag试剂，多糖损失了将近一半，损失率为46.18%。因此，Sevag法采用2次为宜，可作为大量粗蛋白的去除剂。

图1 Sevag法脱蛋白后蛋白质浓度的变化

图2 Sevag法脱蛋白后多糖浓度的变化

2.2.2 TCA法脱蛋白 图3、4是采用TCA法脱蛋白时蛋白质和多糖浓度的变化曲线图。由图可以看出，TCA法脱蛋白效果较好，TCA添加量为0.1mL/10mL多糖溶液时，蛋白脱除率已达到45.08%，而此时的多糖损失率仅为4.23%。随着TCA添加量的增加，蛋白质浓度和多糖逐渐降低。当TCA添加量从1.3 mL/10mL多糖溶液增加至1.6 mL/10mL多糖溶液时，多糖损失率从15.15%增加到了29.17%，当TCA添加量为1.9mL/10mL多糖溶液时，多糖损失率更高达67.93%，而此时的蛋白脱除率并未增加多少，因此选择TCA添加量为1.3mL/10mL多糖溶液。

图3 TCA法脱蛋白后蛋白质浓度的变化

如表1所示，采用Sevag法与TCA法结合的方法蛋白质脱除率最高，达78.68%，而此时的多糖损失率为28.89%，实现了高蛋白脱除率和低多糖损失率的实验目的。

图4 TCA法脱蛋白后多糖浓度的变化

表1 Sevag法+TCA法结合脱蛋白 （%）

2.2 脱色实验

2.2.1 波长的选择 由图5可知，多糖溶液的最长吸收波长在320 nm处，但由于此处读数不稳定，因此，实验过程中选择与最长吸收波长相近但读数相对稳定的325 nm波长处进行实验。

图5 波长扫描图

2.2.2 脱色效果比较 过氧化氢带有过氧键，容易因过氧键断裂生成过氧自由基，该自由基夺电子能力强，有强氧化性。当过氧化氢与色素作用时，有色物质的分子被氧化从而失去原有的颜色，从而起到脱色作用[14]。

多糖中所含的色素一般有两种，即游离色素和结合色素[15-16]。由图6可以看出，脱蛋白后多糖的脱色效果明显好于多糖原液的脱色效果。这可能由于色素多为结合色素，与蛋白质结合，在去除蛋白质的同时带走部分色素。多糖原液的脱色率为29.12%，脱蛋白后多糖的脱色率达到了85.17%。

图6 多糖原液与脱蛋白液脱色效果比较

3 结论

（1）单独采用Sevag法脱蛋白，反应剧烈，多糖损失率较大，不宜选用。TCA方法较温和，脱蛋白效果较好，且多糖损失率不大，适合作为多糖的蛋白去除剂。将Sevag法与TCA法结合脱蛋白效果最佳，Sevag法操作2次，TCA溶液添加量为1.3 mL/10mL多糖溶液，此时蛋白脱除率为78.68%，多糖损失率为28.89%。

（2）脱蛋白后多糖的脱色效果优于多糖原液的脱色效果，多糖原液的脱色率为29.12%，脱蛋白后多糖的脱色率达到了85.17%，约为原液脱色率的3倍。除蛋白质和色素的褐藻糖胶氢呈浅黄色，溶液澄清，色素明显减少，对褐藻糖胶进一步分离纯化非常有益。

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