呼肠孤病毒Ⅲ型免疫荧光检测方法的建立及初步应用

王 吉，卫 礼，岳秉飞，贺争鸣

（中国药品生物制品检定所、国家实验动物质量检测中心，北京 100050）

呼肠孤病毒Ⅲ型（Reo3）属呼肠孤病毒科的正呼肠孤病毒属。此种病毒可感染所有哺乳动物，包括小鼠、地鼠、豚鼠、猫和犬等［1-2］。并且能在人、猴、豚鼠、地鼠、猫、狗、猪和牛的原代肾细胞以及Hela、KB、FL和L细胞等传代细胞中增殖并引起细胞病变。Reo3也能感染人，能引起儿童腹泻、呼吸道感染及脑膜炎等疾病［2-4］。由于上述动物和细胞存在Reo3的自然感染，而用上述动物原材料或细胞而生产的人用生物制品也可能存在Reo3的潜在污染，对人用动物原材料及动物源性生物制品的使用安全性造成潜在威胁［5］。

因此建立Reo3免疫荧光（IFA）检测方法，开展对人用动物原材料及动物源性生物制品外源Reo3的检测，保证生物原材料及制品的使用安全性至关重要。本文旨在建立简单、快速、特异、敏感的免疫荧光检测方法，对人用动物源性生物材料及其制品进行Reo3检测。

1 材料和方法

1.1 主要材料

Reo3毒种、BSC-1细胞、BHK21细胞：本室冻存；免疫荧光素（山羊抗小鼠IgG-FITC）：KPL公司产品；SPF BALB/c小鼠，中国药品生物制品检定所实验动物资源中心生产（许可证号：SCXK（京）2009-0017）；小鼠抗Reo3血清及小鼠阴性血清：本室制备；乙型脑炎减毒活疫苗：本所疫苗一室提供。

1.2 主要仪器

荧光显微镜：Olympus IX；37℃水浴箱：上海森信实验仪器有限公司DK-4500B型；37℃培养箱：WGP-600；多孔荧光片：Thermo公司产品。

1.3 方法

1.3.1 敏感细胞的筛选和病毒感染力滴度（TCID50）测定：选择BHK21细胞和BSC-1细胞分别接种Reo3毒种，每天观察细胞病变（CPE）。待细胞50％～80％发生圆缩病变后，收冻。分别将第3代BHK21细胞毒和BSC-1细胞毒以10-1～10-11作系列倍比稀释，依次加入培养有BHK21细胞和BSC-1细胞的96孔细胞培养板（costor）（1～11列），每个稀释度接种1列（8孔），第12列不加病毒，作为细胞对照。置37℃培养观察10d，记录结果［6］。

1.3.2 Reo3阳性血清与阴性血清的制备：

1.3.2.1 免疫抗原的制备与纯化：收获Reo3细胞毒于4℃，10 000r/min离心1h，取上清液于4℃，40 000r/min离心3h，收集沉淀于适量PBS中。再经20％蔗糖离心后，用紫外分光光度法测定抗原蛋白含量。然后用PBS稀释至1mg/mL，分装后冻存于-70℃备用。

1.3.2.2 免疫接种方法及程序：（1）第一次免疫：取0.3mL纯化Reo3抗原与0.9mL弗氏完全佐剂混匀，腹腔注射6只SPF KM小鼠，每只注射0.2mL。（2）第二次免疫：在第一次免疫后第14天，取0.3mL纯化Reo3抗原与0.9mL弗氏完全佐剂混匀，腹腔注射每只小鼠0.2mL，同时每只腹腔注射0.5mL液体石蜡。（3）第三次免疫：在第一次免疫后第21天，取0.3mL纯化后Reo3抗原，加入0.9mL弗氏完全佐剂中，混匀后腹腔注射每只小鼠0.2mL。

1.3.2.3 抗体的检测：第一次免疫后第35天开始收集腹水，每次收集后2 000r/min离心10min，上清液56℃灭活30min，冻存于-70℃备用，收集的腹水用本室ELISA法测其效价，留取A490＞1.0的腹水混合后分装至1.5mL离心管中冻存于-70℃作为阳性对照备用。

1.3.2.4 阴性对照血清制备：分离的SPF小鼠血清，经Reo3 ELISA检测为阴性的样品，56℃灭活30min，用本室ELISA法测其效价＜0.1，分装至1.5mL离心管中冻存于-70℃作为阴性对照备用。

1.3.3 抗原片的滴定：接种Reo3的敏感细胞，病变达70％～80％，滴片，同时设正常细胞对照。冷丙酮固定，置-20℃冻存备用［7］。

1.3.4 操作和判断标准的确定：依据《中华人民共和国药典》2010版三部和国标进行实验和结果判定。在阴、阳对照成立的情况下，待检血清与正常细胞反应无荧光，与感染细胞反应有荧光判为阳性［7-8］。

1.3.5 免疫荧光素最佳工作浓度的确定：小鼠Reo3阳性血清及阴性血清分别以1：10稀释［7］，羊抗小鼠IgG-FITC以1：50～1：3200进行系列倍比稀释，滴定荧光抗体最佳工作浓度。以出现“++++”的荧光抗体最大稀释比例为其最佳工作浓度。

1.3.6 敏感性试验：将小鼠阳性血清从1：10～1：5120进行系列倍比稀释进行检测，以出现“++”的最大稀释比例为其检测灵敏度；将Reo3细胞毒以10-1～10-11作系列倍比稀释，分别接种BSC-1细胞，48h后分别滴片，与阳性血清进行免疫荧光反应，以检测到出现“++”的病毒感染滴度来确定检测方法的敏感性。

1.3.7 特异性试验：用建立的IFA法分别检测小鼠鼠痘（Ect）病毒和小鼠肝炎病毒（MHV）阳性血清，同时设标准阴、阳对照。用小鼠Reo3阳性血清和阴性血清与小鼠鼠痘（Ect）病毒感染BHK21细胞片进行交叉免疫荧光试验；同时与正常BSC-1细胞和Reo3感染BSC-1细胞进行玻片免疫荧光试验。

1.3.8 稳定性试验：将3个不同批次抗原片同时对小鼠阳性血清从1：10～1：5120进行检测；同1批次抗原片于-20℃保存1个月、3个月和6个月3个不同时间，分别对小鼠阳性血清从1：10～1：5120进行检测，观察其检测结果是否一致。

1.3.9 初步应用：

1.3.9.1 动物抗体的检测：用建立的IFA方法对2008年～2010年国内7个厂家送检60份小鼠血清进行抗体检测，并记录结果。

1.3.9.2 Reo3抗原的检测：利用细胞试验和IFA法对人用动物源性材料及生物制品进行检测。

（1）以国内3个公司生产的9批次乙脑减毒活疫苗为样品进行检测。每批次疫苗接种BSC-1细胞2瓶。同时设细胞对照2瓶，Reo3毒种2瓶。37℃吸附1.5 h，弃掉吸附的检品液体，加入细胞维持液，每d观察细胞形态，每3～4d换液一次，并记录结果。

（2）9批次疫苗接种BSC-1细胞，盲传3代。每代细胞进行滴片，分别与1∶10的阴、阳血清进行免疫荧光反应。同时用已知病毒抗原片作阳性和阴性对照。

（3）选择2010年国内6个不同厂家送检的鼠源性单克隆抗体细胞株10批次，分别接种BSC-1细胞，同时设细胞对照2瓶，Reo3毒种2瓶。每天观察细胞病变情况，并记录结果。盲传2代后的细胞滴片，分别与小鼠阴、阳血清进行免疫荧光反应［8］。

2 结果

2.1 敏感细胞的筛选

BHK21细胞和BSC-1细胞接种Reo3 48h后，均有70％～90％细胞出现CPE，病毒感染力滴度分别为10-5.3/mL和10-5.8/mL。选择BSC-1细胞为Reo3培养细胞。

2.2 Reo3阳性血清与阴性血清的制备

制备免疫用抗原测蛋白浓度为5.1mg/mL。制备阳性对照（免疫血清及腹水A＞1.0）共15.0mL。制备阴性对照血清12.7mL。

2.3 羊抗小鼠IgG-FITC最佳工作浓度的确定（表1）。

滴定结果显示当FITC为1∶100时正常细胞孔与阴、阳对照血清反应均无绿色荧光，也未观察到荧光背景干扰；Reo3感染细胞孔与阴性对照血清反应无绿色荧光，与阳性对照血清反应产生强绿色荧光（图1、2见封二）。

2.4 敏感性试验

抗体检测最大稀释比例为1：1280；检测病毒滴度最低为10-4.7/mL。

2.5 特异性试验

用已建立IFA法检测小鼠鼠痘（Ect）病毒、和小鼠肝炎（MHV）病毒阳性血清，结果均为阴性。Reo3阴性对照和阳性对照与小鼠鼠痘（Ect）病毒感染的BHK21细胞均无交叉免疫荧光反应。

2.6 稳定性试验

3个不同批次抗原片同时对小鼠阴、阳性血清从1：10～1：5120进行检测，和同1批次抗原片于-20℃保存1个月、3个月、6个月三个不同时间对小鼠阳性血清从1：10～1：5120进行检测，检测结果均一致，检测灵敏度均为1：1280。

2.7 应用

2.7.1 动物抗体的检测：IFA法检测60份小鼠血清，有4份抗体阳性，56份抗体阴性。

表1 荧光素工作浓度滴定结果Tab.1 Titration results of the IgG-FITC

2.7.2 细胞接种和免疫荧光试验：（1）细胞接种试验显示，2瓶BSC-1细胞对照连续观察无CPE产生（图3），Reo3毒种使BSC-1细胞发生明显CPE，（图4）；9批次样品接种的3代BSC-1细胞均未发生CPE，检测结果均为阴性（图3，4见封二）。（2）在阴阳对照成立的情况下，9批次样品接种3代BSC-1细胞涂片与小鼠阴性血清及阳性血清均无绿色荧光反应，检测结果均为阴性。（3）细胞接种试验显示在正常细胞对照成立的情况下，10批次鼠源性单克隆抗体细胞株接种BSC-1细胞，均无CPE产生；免疫荧光试验显示，在阴、阳对照成立的情况下，10批次单克隆抗体细胞株接种BSC-1细胞涂片与小鼠阴性血清及阳性血清均无绿色荧光反应，结果均为阴性。

3 讨论

敏感性试验显示抗体检测最大稀释比例为1∶1280；检测病毒滴度最低为10-4.7/mL；特异性试验显示与小鼠易感的其他病毒无交叉反应；稳定性试验显示不同批间和批内重复性试验检测灵敏度一致，均为1∶1280。说明本试验建立IFA法敏感性、稳定性好，特异性强。

本实验BSC-1细胞感染Reo3后，细胞内颗粒增多、细胞肿大、脱落、折光度增加，与Reo3的致细胞病变效应一致（图4），且Reo3阳性血清的检测结果为细胞内出现强绿色荧光反应，为IFA检测中抗原抗体相结合的阳性表现（图2）；Reo3阴性血清的IFA检测结果为红色细胞，未见绿色荧光，为典型的IFA检测阴性表现（图1）；说明所建立的Reo3的IFA法效果较好［10］。

本试验同时用本室建立的ELISA法对上述IFA检测的60份小鼠血清进行Reo3抗体检测。结果显示IFA法检测抗体阳性的4份血清用ELISA法检测，结果均为阳性；IFA法检测抗体阴性的56份血清用ELISA法检测，结果均为阴性，2种方法检测符合率为100％。

用细胞接种和免疫荧光试验相结合检测9批次乙脑减毒活疫苗，3代BSC-1细胞均未发生CPE，3代细胞滴片分别与Reo3阴、阳对照血进行免疫荧光反应，均为阴性。说明9批次疫苗均未被Reo3活毒感染。保证了疫苗使用的安全性。

同时用建立的IFA法检测了2010年国内6个厂家送检的鼠源性单抗细胞株10批次，结果显示均为阴性。与本室做的动物安全试验、动物抗体产生试验、鸡胚接种和血凝试验检测结果一致，也说明了检测结果的准确性和可靠性。

本试验通过筛选，确定了Reo3敏感细胞，并滴了抗原片，为以后建立如大鼠、地鼠、等其他动物Reo3 IFA检测方法的建立奠定了基础。

本试验建立IFA法具有操作简便、快速、敏感、特异等特点［11］，利用细胞接种和免疫荧光相结合的检测方法具有稳定性好、检测结果可靠等特点，可应用于动物源性生物材料及生物制品外源Reo3的检测。

［1］侯丽波，佟巍，谢军芳，等.小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型标准化血清制备及ELISA检测方法的建立.中国比较医学杂志［J］.2010，20（8）：60-64.

［2］赵亚力，孙衍庆，周捷，等.外源3型呼肠孤病毒污染原代地鼠肾细胞的光镜及电镜诊断［J］.中国生物制品学杂志，2001，14（1）：33-35.

［3］Roner MR，Steele BG.Features of the mammalian orthoreovirus 3 dearing l1 single-stranded RNA that direct packaging and serotype restriction.J Gen Virol，2007，88：3401-3412.

［4］Tyler KL，Barton ES，Ibach ML，et al.Isolation andmolecular characterization of a novel type 3 reovirus from a child with meningitis.J Infect Dis.2004，189（9）：1664-7165.

［5］王吉，卫礼，巩薇，等.乙型脑炎病毒（JEV）单克隆抗体的制备及初步应用［J］.实验动物科学与管理，2006，23（3）：1-4.

［6］王吉，高正琴，卫礼，等.乙型脑炎病毒（JEV）IFA检测方法的建立［J］.实验动物科学，2010，27（4）：1-5.

［7］中华人民共和国国家标准，实验动物 微生物学检测方法［S］.免疫荧光试验，GB/T 14926.51-2001：10-12.

［8］绍明立，马晓伟，吴浈，等.《中华人民共和国药典》［S］.2010，三部（附录XII H），鼠源性病毒检查法：108-109.

［9］王军志，贺争鸣，岳秉飞，等.生物技术药物研究开发和质量控制［M］.北京：科学出版社，2002：325-334.

［10］常继涛，李鑫，张亚科，等.犊牛腹泻粪样中牛呼肠孤病毒的分离鉴定［J］.中国预防兽医学报，2008，30（9）：711-715.

［11］Wright MH，Cera LM，Sarich NA，et al.Reverse transcriptionpolymerase chain reaction detection and nucleic acid sequence confirmation of reovirus infection in laboratory mice with discordantserologic indirectimmunofluorescence assay and enzyme-linked immunosorbent assay results.Comp Med.2004，54（4）：410-417.