感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠心、肾AT1R的表达

殷丽天，李 媛，李 莉，崔慧慧，黄 幸，杨建一

（山西医科大学基础医学院，太原 030001）

高盐摄入被认为是高血压发生最重要的因索之一［1］。20世纪70年代，Luft等［2］根据高血压患者对高盐摄入后的血压反应及潴钠的程度，首先提出了盐敏感性的概念。之后，对于盐敏感性高血压的研究逐步展开。盐敏感性高血压是指由于相对高盐摄入所引起的血压升高［3-6］。除流行病学外，对盐敏感性高血压的研究多采用动物模型进行。血压升高过程涉及到肾素-血管紧张素系统（RAS）和各种细胞因子的作用，血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是RAS的主要活性肽，AngⅡ的大多数生理效应是通过细胞表面的血管紧张素Ⅱ性受体（angiotensinⅡ type 2 receptor，AT1R）进行的。AT1R主要存在于血管平滑肌表面、上皮细胞、心肌细胞、心脏成纤维细胞和肾小球膜细胞等，其激活导致血管收缩，升高血压等。国内外学者研究发现自发性高血压大鼠（SHR）肾素血管紧张素系统研究已有一定进展［7］，但在感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠模型尚未见报道。在盐敏感性高血压大鼠中，血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）的表达如何？本研究建立感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠模型，观察探讨大鼠心肌和肾脏组织中AT1R在基因和蛋白水平的表达水平，探讨其在盐敏感性高血压发病机制中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性Wistar大鼠，由山西医科大学生理学系实验动物室提供［合格证号：医动字第070102，动物实验室许可证号：SYXK（晋）2009-0001号］。

1.2 主要仪器设备

YD-202C切片机，浙江金华市益迪医疗设备厂；Progene Techne PCR扩增仪；DYY-7C型电泳仪，北京六一仪器厂；JY-SPCT水平电泳槽，北京君意东方电泳设备有限公司；Neofuge15R台式高速冷冻离心机，上海力申科学仪器有限公司；Tanon 2500凝胶成像系统，天能（上海）科技有限公司；UV-2602型紫外分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；BL-410生物信号显示与处理系统，成都泰盟电子有限公司；HX-Ⅱ小动物血压计。

1.3 药品与试剂

辣椒辣素（CAP），美国Sigma公司；苏木素，FMP公司；溴化乙锭（EB），美国Sigma公司分装；琼脂糖，Solarbio公司；高效切片石蜡，上海华申康复器材有限公司生产；免疫组化试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司生产；RT-PCR试剂盒，宝生物工程有限公司（大连）生产。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型复制及分组：参考相关文献［8］建立模型与分组：雄性Wistar大鼠生后第1～2天，实验组皮下注射辣椒辣素50mg/kg（溶解在含5％乙醇、5％吐温80的生理盐水中）；对照组皮下注射同体积的溶液（含5％乙醇、5％吐温80的生理盐水）。哺乳期（3周）后，雄性大鼠被随机分成以下4组：对照+正常盐饮食组（饲料中含1％NaCl，CON-NS）；对照+高盐饮食组（饲料中含4％NaCl，CON-HS）；辣椒辣素+正常盐饮食组（CAP-NS）；辣椒辣素+高盐饮食组（CAP-HS）。每组8只动物分别接受以上不同的处理4周。

1.4.2 实验过程：分组时及分组后各周用尾套法测量大鼠清醒时尾收缩压，测三次取均值。动物8周龄时模型建立。心尖部取约100mg心肌组织，置于冻存管，液氮中保存，准备行RT-PCR检测。沿房室环剪去大血管、心房及右室游离壁，将余下的室间隔、左室游离壁作为左心室，左心室侧壁取一块状心肌组织，以4％甲醛液固定，准备行免疫组化检测；取右侧肾脏约100mg组织，置于冻存管，液氮中保存，用于RT-PCR检测；左侧肾脏组织，以4％甲醛固定，准备行免疫组化检测。

1.4.3 免疫组化检测大鼠心肌和肾脏AT1R蛋白表达：操作步骤按免疫组化试剂盒说明书进行。用Image-Pro Plus 5.1图像分析软件分析大鼠心肌和肾脏AT1R的表达水平，以吸光度（A）值表示其相对含量。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

表2 各组大鼠血压的变化（±s，n=8）Tab.2 Changes of the blood pressure the rats of the four groups（±s，n=8）

表2 各组大鼠血压的变化（±s，n=8）Tab.2 Changes of the blood pressure the rats of the four groups（±s，n=8）

注：*与CON-NS组比较，P＜0.01。Note：* Compared with the CON-NS group，P＜0.01.

组别Group血 压 值（mmHg）Blood pressure（mmHg）0周0 week 1周1 week 2周2 weeks 3周3 weeks 4周4 weeks CAP-HS 89.50±10.02 115.50±10.20 128.25±15.67 136.507±9.97* 152.13±10.05* CAP-NS 86.00±9.52 107.13±8.76 115.63±14.00 117.50 ±12.68 116.50±9.84 CON-HS 87.75±12.66 113.00±11.56 123.13±13.12 126.50 ±9.75 123.00±8.91 CON-NS 85.38±8.14 109.63±10.50 118.75±12.16 116.13 ±10.30 115.63±12.21

1.4.4 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测大鼠心肌和肾脏AT1RmRNA表达：操作步骤按试剂盒说明书进行。从NCBI的nucleotide中查得目的基因，用Primer Premier 5.0设计ACE和ACE2上下游引物。AT1R、β-actin的序列参考Lan He等［9］文献设计，进行产物半定量分析，比值表示其相对含量。各对引物序列如表1。

1.5 统计学方法：

用SPSS 11.5统计软件进行统计分析。实验结果以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析检验其显著性。

2 结果

2.1 收缩压变化

在实验过程中各组大鼠尾收缩压均有明显增加。从第2周开始，CAP-HS组尾收缩压开始高于正常组，到第3、4周，CAP-HS组的尾收缩压与CON-NS组比较差异有显著性（P＞0.05）。CAPNS、CON-HS、CON-NS三个组的尾收缩压均在正常血压范围之内，差异不显著（表2）。

2.2 大鼠心肌和肾脏组织AT1R蛋白表达

CAP-HS组大鼠肾脏组织中AT1R蛋白呈弥散性高表达（图1）；CAP-NS组有少量表达（图2）；CON-HS组表达较多（图3）；CON-NS组表达同CAP-NS组相似，少量表达（图4）。在心肌组织中，CAP-HS组组织中高表达AT1R蛋白（图5）；CAPNS组有少量表达（图6）；CON-HS组表达也比较多（图7）；CON-NS组表达同CAP-NS组相似，有少量表达（图8），（图1～8见彩插1）。

2.3 免疫组织化学图像分析

采用Image-Pro-Plus图象分析软件对免疫组化染色切片进行计量分析。随机从每张切片左上、左下、右上、右下和中部采集5个区域计算每个视野阳性染色的累积光密度值（integrated optical density，IOD），对免疫组化进行定量分析，计算心肌、肾脏组织中AT1R的表达量。IOD是阳性面积与阳性平均光密度的乘积。面积越大，光密度越大，IOD的值越大。分析方法同Gomori染色图像分析。

CAP-HS组大鼠心肌、肾脏组织中AT1R蛋白表达阳性率远远高于CON-NS组，具有统计学意义，P＜0.01；CON-HS组AT1R蛋白表达阳性率较CONNS有差异，且P＜0.05（表3）。

表3 各组大鼠心肌、肾脏AT1R免疫组化IOD值比较（±s，n=8）Tab.3 Comparison of IOD of kidney and heart in the rats of the four groups（±s，n=8）

表3 各组大鼠心肌、肾脏AT1R免疫组化IOD值比较（±s，n=8）Tab.3 Comparison of IOD of kidney and heart in the rats of the four groups（±s，n=8）

注：＊＊与CON-NS比较，P＜0.01；*与CON-NS比较，P＜0.05。Note：＊＊Compared with the CON-NS group，P＜0.01；*Compared with the CON-NS group，P＜0.05.

组别Group 心肌Heart 肾脏Kidney CAP-HS 31979.5±7873.6＊＊ 30942.8±2252.1＊＊CAP-NS 9747.8±5215.8 3802.1±643.8 CON-HS 15370.7±4621.6* 10571.1±1126.2* CON-NS 8116.9±4988.8 3682.9±780.6

2.4 肾脏、心肌组织AT1RmRNA表达

RT-PCR结果显示，肾脏、心肌组织AT1RmRNA表达中：β-actin在228bp位置上有清晰明亮的条带，亮度相似（图9、图10）；肾脏和心肌组织中的AT1R表达在464bp位置上有清晰条带，但明亮程度有差别。其中第4泳道CAP-HS组AT1RmRNA条带最亮，第2泳道CON-HS组条带次亮，第3、1泳道CAPNS、CON-NS组亮度相似（图11、图12）。

图9 各组大鼠肾脏AT1R与β-actin表达电泳图Fig.9 AT1R and β-actin expression in the kidney

图10 各组大鼠心肌AT1R与β-actin表达电泳图Fig.10 AT1R and β-actin expression in the heart

图11 各组大鼠肾脏AT1RmRNA表达电泳图Fig.11 AT1RmRNA expression in the kidney

图12 各组大鼠心肌AT1R mRNA表达电泳图Fig.12 AT1R mRNA expression in the heart

2.5 大鼠肾脏、心肌组织AT1R mRNA表达分析

采用凝胶成像系统和紫外分光光度计分析AT1R mRNA表达。大鼠心肌组织CAP-HS组和COH-HS组AT1R mRNA的表达与其CON-NS组比较差异有显著性（P＜0.01）；肾脏组织中，CAP-HS组表达与CON-NS组比较差异有显著性（P＜0.01）；CON-HS组较CON-NS比较差异有统计学意义，且P＜0.05（表4）。

表4 各组大鼠心肌、肾脏组织AT1R mRNA表达图像分析IOD值比较（±s，n=8）Tab.1 Image analysis of the IOD of AT1R mRNA in the heart and kidney of rats（±s，n=8）

表4 各组大鼠心肌、肾脏组织AT1R mRNA表达图像分析IOD值比较（±s，n=8）Tab.1 Image analysis of the IOD of AT1R mRNA in the heart and kidney of rats（±s，n=8）

注：＊＊与CON-NS比较，P＜0.01；*与CON-NS比较，P＜0.05。Note：＊＊Compared with the CON-NSgroup，P＜0.01；*Compared with the CON-NS group，P＜0.05

组别Group 心肌Heart 肾脏Kidney CAP-HS 0.779±0.04＊＊ 0.711±0.05＊＊CAP-NS 0.311±0.01 0.318±0.05 CON-HS 0.609±0.01＊＊ 0.463±0.07* CON-NS 0.303±0.04 0.305±0.06

3 讨论

AT1R的激活可以产生血管收缩、升高血压、细胞增殖、氧化、醛固酮释放、水钠重吸收、血管内皮细胞生长以及纤维化等作用。AT1R主要存在于血管平滑肌表面（VSMCs）、上皮细胞、心肌细胞、心脏成纤维细胞和肾小球膜细胞，介导血管舒缩、水盐代谢以及血管平滑肌细胞增殖与肥大、功能调节等生理学效应，是RAS作用于效应器的关键环节。据研究，除细胞膜上有AT1R外，细胞核及染色体上也均发现有AngⅡ的特异性结合位点。细胞自身合成的AngⅡ能以胞内分泌的方式通过细胞核及染色体上的AngⅡ特异性结合位点介导其生理功能［10］。

高血压疾病中，AngⅡ是主要的缩血管物质和致血管重构的重要因素。AngⅡ调节血管结构及功能的主要过程是与其特异的受体（AT1R）结合，激活PLC-β（G蛋白偶联的磷脂酶C-β），产生两种重要的第二信使分子，三磷酸肌醇（IP3）和三酰甘油（DAG），导致细胞内钙释放和蛋白激酶C激活，并对包括转录因子在内的多种底物进行磷酸化调节，发挥生物学效应［11，12］。后来发现，AngⅡ与AT1R结合后，还可激活可溶性酪氨酸激酶PP60，然后磷酸化和刺激PLC-γ1，PLC-γ1进一步水解磷酯酰肌醇，最终生成IP3和DAG。IP3可激活肌浆网，致细胞内Ca2+释放，细胞内钙增加又可激活低电导的氯离子通道，使膜去极化激活钙通道，致钙内流增加［13，14］。一方面使游离Ca2+浓度增高，另一方面通过特异的离子流激活核基因及增加胞浆蛋白合成。AT1R介导多种活性，其表达是通过AngⅡ，生长因子、雌激素、类固醇、低密度脂蛋白的改变来完成的［15，16］。

本课题组曾经在感觉神经损伤性高血压大鼠中研究RAS系统中ACE和ACE2的表达［17］，作为此系统中血管紧张素的相应受体（AT1R），本研究进一步用免疫组化法和RT-PCR法分别检测AT1R在蛋白和mRNA水平的表达，进一步阐明RAS系统在盐敏感性高血压中的作用。分析结果显示，CAPHS组大鼠的心肌、肾脏组织AT1R的表达与CONNS组比较差异均有显著性（P＜0.01），提示血压明显升高，AT1R的表达显著增多。结果与黄建寨等［18］在SHR（自发性高血压）和RHR（肾性高血压）大鼠所作结果基本一致。CON-HS组心肌AT1R mRNA表达较肾脏更为显著，出现此结果的原因可能与左心室肥厚有关［19］。以上说明，感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠心肌和肾脏组织中存在AT1R mRNA和蛋白的高表达，AT1R mRNA和蛋白的高表达与大鼠血压有一定的相关性。对于探讨盐敏感性高血压发病机制，以及临床使用AT1R拮抗剂防治高血压及其所带来的危害有一定的临床意义。至于AT1R蛋白和mRNA在其他组织中的表达情况，例如血管、脑等与高血压密切相关的器官中是否有同样结果或差异，将进一步研究。

［1］卢荔红，陈慧，骆杰伟，等.a-adducin基因与盐敏感性高血压、肾损害的相关性［J］.中国分子心脏病学杂志2007，7（2）：66-71

［2］Luft FC，Grim CE，Willis LR，et al.Natriuretic response to saline infusion in normotensive and hypertensive man.The role of renin suppression in exaggerated natriuresis［J］.Circulation，1977，55（5）：779-784.

［3］Beeks E，Kesseis AG，Kroon AA，et al.Genetic predisposition to salt-sensitivity：a systematic review［J］.Hypertetions，2004，22（7）：1243-1249.

［4］Hurwitz S，Fisher ND，Ferri C，et al.Controlled analysis of blood pressure sensitivity to sodium intake：interactions with hypertention tpye［J］.Hypertens，2003，21（5）：951-959.

［5］Weinberger MH.Sodium and blood pressure 2003［J］.Curr Opin Cardiol，2004，19（4）：353-356.

［6］王曼，牟建军，陈恩让，等.血压盐敏感性及相关因素家庭聚集性分析［J］.中国公共卫生，2007，23（1）：38-39.

［7］王东，蒋湘莲，聂亚雄.高血压大鼠模型的研究进展［J］.中国动脉硬化杂志，2006，14（3）：271-273.

［8］Wang DH，Li JP，Qiu JX.Salt-sensitive hypertension induced by sensory denervation：introduction of a new model［J］.Hypertension，1998，32：649-653.

［9］He L，Qi Y，Rong X，et al.The Ayurvedic medicine Salacia oblonga attenuates diabetic renal fibrosis in rats：suppression of angiotensinⅡ/AT1 signaling［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2009，Aug 25（Epub ahead of print）

［10］郑红霞，罗兵.AT1R基因与人类疾病的相关性研究［J］.中国实用医药，2007，2（5）：91-92

［11］Regitz-Zagrosek V，Neuss M，Holzmeister J，et al.Molecular biology of angiotensin receptor and their role in human cardiovascular disease［J］.Mol Med，1996，74（5）：233-251.

［12］Leclerc PC，ProulxCD，Arguin G，etal.Ascorbicacid decreases the binding affinity of the AT1 receptor for angiotensinⅡ［J］.Am J Hypert，2008，21（1）：67-71.

［13］Griendling KK，Ushio-Fukai M，Lassegue B，et al.Angiotensin signaling in vascular smooth muscle［J］.Hypertension，1997，29（1 pt 2）：366-373.

［14］Schieffer B，Paxton WG，Marrero MB，et al.Importance of tyrosine phosphorylation in angiotensin Ⅱ type 1 receptor signaling［J］.Hypertention，1996，27（3 pt 2）：476-480.

［15］Mueller CF，Wassmann K，BergerA，etal.Differential phosphorylation of calreticulin affects AT1 receptormRNA stability in VSMC［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，370（4）：669-674.

［16］Mueller CF，Berger A，Zimmer S，et al.The heterogenous nuclear riboprotein S1-1 regulates AT1 receptor gene expression via transcriptional and posttranscriptional mechanisms［J］.Arch Biochem Biophys，2009，488（1）：76-82.

［17］崔慧慧，李莉，杨建一，等.感觉神经损伤性盐敏感性大鼠心肾ACE和ACE2的表达［J］.中国比较医学杂志，2010，20（8）：38-43.

［18］黄建寨，魏立，王晓军，等.高血压大鼠心肌肾素-血管紧张素系统的日变化［J］.中国临床药理学与治疗学杂志，2006，11（8）：863-867.

［19］李媛，李莉，崔慧慧，等.感觉神经损伤性盐敏感性大鼠左心室肥厚与血压的关系［J］.中国比较医学杂志，2009，19（11）：38-41.