长爪沙鼠脑底动脉Willis环变异缺失遗传特性分析及脑缺血模型高发群体的初步培育

周好乐，杜小燕，路 静，王 迎，陈振文

（1.首都医科大学实验动物部，北京 10086；2.内蒙古医学院遗传学教研室，呼和浩特 010059）

长爪沙鼠是源自我国的“多功能”实验动物［1］。由于其脑底动脉环前后交通支存在不同程度的缺失，不能构成完整的Willis动脉环而成为天然的脑缺血动物模型，已作为研究脑缺血或脑梗塞后大脑各种基因激活与表达变化、各种神经递质的代谢变化、大脑组织的病理学变化以及脑缺血或脑梗塞治疗的理想模型得到广泛应用［2-4］。但遗憾的是，大量研究结果显示，有这一特点的长爪沙鼠仅有（30～40）％，换言之，只有35％的长爪沙鼠单侧结扎颈总动脉后出现典型脑缺血症状，成为可用的脑缺血动物模型［5，6］。其余动物中约有一半在短时间内死亡，另一半根本无脑缺血症状产生。科学家们一直在寻找可以预测长爪沙鼠脑缺血发生情况的方法［7-9］，但到目前为止，尚不能解决由于Willis环变异种类多而造成单侧结扎颈总动脉脑缺血模型不稳定和不均一的问题。因此，通过动物的定向培育来降低前后交通动脉的变异，即培育前后交通支缺失的长爪沙鼠群体是解决问题的根本途径。本研究拟通过对长爪沙鼠亲代与子代脑底动脉Willis环变异缺失类型的观察，研究其前、后交通支变异情况的遗传特性。并以此为依据，定向培育长爪沙鼠脑缺血模型高发生率群体。

1 材料和方法

1.1 实验动物

长爪沙鼠（首都医科大学实验动物科学部提供），398只，合格证号SCXK（京）2000-0012，清洁级。动物自由饮水和采食，饲料购于维通利华饲料有限公司。室温为（22±2）℃，相对湿度50％～70％，人工光照明暗各12h。

1.2 长爪沙鼠脑底动脉Willis环变异缺失遗传特性分析

从刚离乳的仔沙鼠中随机选取10对，雌雄配对后采取长期同居法单笼饲养，待沙鼠性成熟后自然交配繁殖。当产下的第1窝子代成熟后，按照文献方法［5］对所有子代动物行右侧颈总动脉结扎，观察术后症状及脑缺血模型的发生率，然后心脏灌注血管铸型，解剖观察子代的Willis环变异缺失类型。让亲代继续繁殖第2和第3窝（第2窝产子数少或雌雄比例不当时生产第3窝），待第2和第3窝仔鼠成熟后，让同父母雌雄个体配对繁殖下一代。同时将亲代雌雄个体动物行右侧颈总动脉结扎，观察术后症状及脑缺血模型的发生率，然后心脏灌注血管铸型，解剖观察子代的脑底动脉Willis环变异缺失类型，并与其子代的术后症状、脑缺血模型的发生率和Willis环变异缺失类型进行比较。按此方法繁殖并比较观察5代动物。记录所有长爪沙鼠脑底动脉Willis环类型观察结果，然后通过对父母与子代的脑底动脉Willis环血管类型分析找出亲代与子代的Willis环变异缺失的遗传特点。

1.3 长爪沙鼠脑缺血模型高发生率培育

选取上述实验中长爪沙鼠行单侧颈总动脉结扎后脑缺血模型发生率高（＞50％）、模型症状典型、亲代和子代脑底动脉Willis环后交通支缺失伴前交通支细小或缺失的兄妹动物进行繁殖。在保证动物连续繁殖不断代的前提下，将亲代和子代动物行右侧颈总动脉结扎，观察术后症状及脑缺血模型的发生率，然后心脏灌注血管铸型，解剖观察脑底动脉Willis环变异缺失类型，并将亲代与其子代的术后症状、脑缺血模型的发生率和Willis环变异缺失类型进行比较，从而验证所推测的遗传规律，定向培育长爪沙鼠脑缺血高发生率种群。

1.4 数据分析

使用SPSS11.5软件用皮尔逊检验（Pearson Chi-Square）对不同Willis环变异类型与父母遗传关系之间的差异，判断不同 Willis环变异类型与父母的遗传关系有无差异。

2 结果

2.1 长爪沙鼠脑底动脉Willis环变异缺失的遗传特性分析

通过对长爪沙鼠F1至F5代51对种鼠及其子代共计398只动物的脑底动脉Willis环解剖比较观察，发现长爪沙鼠脑底动脉Willis环的变异缺失类型具有明显的遗传性。当双亲的Willis环前交通支都完整时，其子代均具有完整的前交通支；而当亲代存在前交通支变异时，其子代可出现多种类型的前交通支变异情况。同样子代后交通支的变异情况也与其亲代有遗传相关性。其中前交通支与母亲一致率为60.4％，前交与父亲的一致率为48.2％，两者的差异有显著性意义P=0.015；后交与父母的差异没有显著性意义P=0.055。不同Willis环变异的遗传情况见表1。

表1 父母与子代的Willis环前交通支相关性Tab.1 The relationship of ACoAs in the parents and children

表2 F1代到F5代长爪沙鼠的CoW类型和症状的分析Tab.2 Analysis of COW patterns and symptoms from generations F1to F5

2.2 长爪沙鼠脑缺血模型高发生率和低发生率群体的培育

随着定向培育长爪沙鼠脑缺血高发生率种群代数的增加，行单侧颈总动脉结扎时，高发种群脑缺血模型成功率随着培育代数的增加而逐渐提高，已由F1代的40％上升到F5代的75％（图1）。

图1 经单侧颈总动脉结扎后脑缺血模型动物中神经评分大于等于2的动物数随培育代数的增加而提高Fig.1 The percentages of UCO cerebral ischemic animals with neurological score of 2 and above were increaseing with the number of breeding generations

随着定向培育代数的增加前后交通支的变异缺失也逐渐趋同，从F1～F5代脑缺血模型高发群体脑底动脉Willis环变异缺失类型变化的统计结果显示：Willis环前交通支细小或缺失率由F1的35％上升到F5的63.6％；Willis环后交通支细小或缺失率由F1的45％上升到F5的77.3％。模型症状的发生率和显著成度也逐步提高（表2）。

3 讨论

3.1 脑底动脉Willis环变异缺失的遗传性

由于目前还不清楚Willis环变异缺失的机制，科学家认为该变异与遗传有关。本实验首先进行了Willis环遗传特性分析，结果显示：当双亲的Willis环前交通支都完整时，其子代大部分具有完整的前交通支；而当亲代存在前交通支变异时，其子代可出现多种类型的前交通支变异情况；子代的个体间表型并没有明显的性别间差异；同样子代后交通支的变异情况也与其亲代有遗传相关性。统计结果显示：前交与母亲一致率为60.4％，前交与父亲的一致率为48.2％，两者的差异有显著性意义P=0.015。由此进一步证明了长爪沙鼠脑底动脉Willis环的变异缺失具有明显的遗传性，且前交通动脉与母亲的关系更密切。

3.2 脑缺血高发模型种群定向培育

长爪沙鼠脑底动脉解剖结构的变异导致长爪沙鼠半脑缺血模型不稳定和不均一，虽然有多个学者试图通过眼底血流等方法预测脑缺血的发生［7-9］，但并没有彻底解决这个问题。因此，本实验从定向培育高发群体入手，使长爪沙鼠群体的解剖结构趋于一致，从根本上解决长爪沙鼠脑缺血模型发生率低的问题。实验结果证明该方法具有一定的可行性，通过同父母的第一窝动物预测第二窝的缺失率，并进行定向培育半脑缺血高发生率群体，使动物右侧颈总动脉结扎后脑缺血模型的成功率由F1代的40％上升到F5代的75％。通过对F1～F5代脑缺血模型高发群体的血管类型变化及症状变化的统计显示：前交通支细小或缺失的百分率由F1代的35％上升到F5代的63.6％；后交通支细小或缺失的百分率由F1代的45％上升到F5代的77.3％；造模成功率由F1代的40％上升到F5代的75％。由于在群体培育中部分采用了近交方式，因此繁殖到F4代以后遇到了近亲交配引起的繁殖障碍，主要表现为：种鼠生育周期延长、生育能力下降、哺育能力下降和仔鼠畸形等情况，导致种群的培育过程放缓。为了克服近亲阻滞带来的不良影响，在保证脑底动脉Willis环的变异缺失类型相同的前提下采取回交的培育方式，本实验中采用回交方法配7对，均成功繁育出下一代。由于沙鼠的生活习性等问题，尚未见沙鼠成功回交的文献报道。目前为止，只有Fujisawa等［10］对长爪沙鼠定向培养了癫痫敏感和低发近交系的报道。尽管在首都医科大学脑缺血高发群体中到F5代时脑缺血模型成功率达到75％，但如何保持这一高发生率仍然是个问题，因此，下一步我们将（事实上我们已经开始）培育脑缺血高发的近交系长爪沙鼠，来进一步提高Willis环类型的一致性和单侧结扎颈总脑缺血模型的稳定性。

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