环状脂肪酸芽孢杆菌的检测与控制研究进展

赵贵明 赵勇胜 杨海荣 陈颖

(中国检验检疫科学研究院 北京 100123)

1 前言

环状脂肪酸芽孢杆菌 (Alicyclobacillus spp.)(简称环脂酸芽孢杆菌)是广泛存在于自然界中的一群耐热、嗜酸并可形成芽孢的杆菌,该类菌在酸性环境 (如果汁中)生长良好,其芽孢甚至在 pH＜3.7的高酸性果汁中经受巴氏杀菌过程仍能存活[1]。1984年 Cerny等从腐败的苹果汁中分离出该类菌株,随后研究确认该菌就是导致果汁腐败的微生物[2]。事实上,早在 1971年就首次从酸热环境中分离出该类芽孢杆菌[3],尽管该类菌对人类健康并不造成直接危害,但由其形成的芽孢萌发后在代谢过程中产生愈创木酚和卤酚,1×10-12的含量就能造成果汁风味败坏并产生轻微沉淀,因此如何消除果汁腐败成为果蔬加工业关注的主要问题[4]。

对环脂酸芽孢杆菌的研究,过去集中在生物学特性、分类学方面,并且主要研究内容是在此基础上的快速检测和有效控制。然而,由于检测方法不够便捷,主要体现在检测周期太长[5]或产生腐败后才会被检测出,因此,产品往往流通到消费者手中腐败才会被发现;而在控制技术研究方面,现有生产工艺还不能完全满足对环脂酸芽孢杆菌越来越严格的限量要求。本文就环脂酸芽孢杆菌的检测方法及控制研究等方面进行系统分析和综述。

2 环脂酸芽孢杆菌的基本生物学特性及其分类

了解环脂酸芽孢杆菌的基本生物学特性及其分类对检测方法与控制技术的研究具有重要意义。

2.1 基本生物学特性

环脂酸芽孢杆菌除 A.sendaiensis是革兰氏阴性菌外,其余均为革兰氏阳性杆菌,部分菌在菌体老化后,革兰氏染色具有可变性[6];除 A.pohliae有时表现出在厌氧条件下生长外,其他各种都是需氧条件下生长;绝大部分菌有动力;除 A.disulfidooxidans,A.tolerans和 A.ferrooxydans三株菌可在低于20℃生长外,该类菌的生长温度范围为 20-70℃,最适生长温度范围为 35-65℃。研究发现,该类菌细胞膜中独特的ω-环己烷脂肪酸结构和藿烷化合物结构与其嗜酸耐热特性相关。pH高低对该类菌的热抗性会产生影响,D值随 pH的下降呈线性下降。该类菌只要在 20℃以上就可在 pH2.5-pH6.0范围内的培养基上生长,其芽孢则能在浓缩果汁和类似环境中存活相当长时间[1]。

2.2 分类

根据Bacillus acidocaldarius,Bacillus acidoterrestris,和 B acillus cycloheptanicus三株菌和相关芽孢杆菌的 16SrDNA基因序列分析结果,Wisotzkey申请了一个新属,A licyclobacillusgen.nov.,即环脂酸芽孢杆菌属[7],名称也得到了相应更改,上述 3株菌是该属的典型种,随后研究者们在火山附近、土壤和酸败的果汁中又陆续发现新种[5,8],然而,目前认为引起果汁腐败的主要菌是该属的酸土环脂酸芽孢杆菌(A.acidoterrestris)和酸热环脂酸芽孢杆菌 (A.acidocaldarius)。

3 环脂酸芽孢杆菌的检测方法

3.1 分离与计数

样品制备、培养条件是影响环脂酸芽孢杆菌分离效果的主要因素。样品制备包括稀释和热处理,尤其是热处理,可以刺激芽孢萌发,研究表明,最佳效果是 80℃下作用 10min[9];样品稀释也十分必要,主要原因是果汁中的可溶性固形物会对该类菌的生长产生影响[10],1:10是通常采用的稀释方式。培养条件的影响主要表现在环脂酸芽孢杆菌需要在酸性环境中生长,还需要刺激生长的某些矿物质。常用的培养基有 K氏琼脂、YSG(yeast starch glucose)琼脂、BAT琼脂 (B acillus acidoterrestris agar)、BAM 培养基 (Bacillus Acidocaldariusmedium)、OSA培养基 (orange serum agar)、PDA培养基(patato destrose agar)等。

计数方法包括直接计数法和增菌培养法。直接计数法分滤膜法和涂布法,滤膜法适用于易过滤样品,涂布法适宜于检测高污染量的样品[11];对低污染量同时又不适宜过滤的样品,只能采取增菌后的定性检测方法。

在样品处理和计数方法确定后,所选择的培养基就成为影响结果的主要因素。BAM培养基是分离出第一株环脂酸芽孢杆菌使用的培养基[2],也是目前ATCC推荐用于参考菌株复活和分离的培养基,主要用于分离 A.hesperidum,A.genom icspecies 1、A.genom icspecies2和 A.cycloheptanicus,也用于生长特性测定实验;OSA培养基用于分离桔汁中的微生物,也包括环脂酸芽孢杆菌;PDA培养基分离的环脂酸芽孢杆菌具有良好的再生性,但必须将 pH值调至 3.5[12];YSG培养基用于分离酸性饮料中的环脂酸芽孢杆菌,是目前日本 NDM公司采用的培养基;K氏培养基对环酯酸芽孢杆菌属内多个种具有较高回收率,是美国库克实验室、雀巢公司采用的培养基,经 AOAC测试,由于它能更快速的得到目标菌而且对菌株有良好的再生性,因此成为目前应用最为广泛的培养基,也是国际果汁生产者联合会 (IFU)标准方法中推荐的培养基[11]。Chang等还对 K氏培养基进行了改良,通过优化、改良后的 SK琼脂比 K氏培养基具有更高灵敏度和低检测限[13]。在对果汁中环脂酸芽孢杆菌的分离与计数研究中还发现,除单个培养基的不同特性影响之外,前增菌和分离环节中采用不同组合也会对分离结果产生影响[14]。

传统方法判断实验结果的依据就是环脂酸芽孢杆菌在 pH ＜4.0(BAT培养基)可生长,而在 pH＞6.0时不生长,然而,除环脂酸芽孢杆菌以外是否还有其他芽孢杆菌也能在同样生长条件下生长,这需要进一步研究。

3.2 分子生物学检测方法

Christopher基于环脂酸芽孢杆菌属 16SrRNA基因序列建立了检测果汁产品中环脂酸芽孢杆菌的实时荧光 PCR方法[15]。Christopher采用文献中提出的 (Weisburg et al.,1991)8F和 1492R引物,以3株环脂酸芽孢杆菌代表性菌株 ATCC43030、ATCC49025和 ATCC49029的 DNA为模板,通过常规 PCR方法扩增出 1500bp的 16SrRNA,然后进行克隆测序 (GenBank编号分别为 AY573796,AY573797和 AY573798),根据序列设计引物和荧光探针 ,CC16S-F,5’CGTAGTTCGGATTGCAGGC3’,CC16S-R,5 ’GTGTTGCCGACTCTCGTG3 ’,探 针CC16S-探针5’CGGAATTGCTAGTAATCGC3’。特异性检测实验表明,检测的目标菌能够覆盖环脂酸芽孢杆菌属,检测样品可以是肉汤培养物或果汁,在少于 100个菌时仍能检测,并且和其他食源性致病菌无交叉反应。在目前的传统方法只能通过生长试验、缺乏特殊鉴定手段的情况下,分子生物学方法不失为一种可靠的鉴定手段。

3.3 傅里叶红外光谱技术

Elizabeth等应用衰减全反射红外光谱技术 (attenuated total reflectance infrared microspectroscopy,ATR-I R)建立了简单、快速和灵敏的环脂酸芽孢杆菌检测方法[16]。在建立方法过程中,将环脂酸芽孢杆菌的稀释液通过疏水网膜过滤,再将疏水网膜置于 OSA培养基上在 50°C下培养 36-48h后进行真空干燥,然后使用 ATR-IR光谱仪采集图谱后采用过变量分析方法进行分析。结果显示,通过簇类独立软模式法,可以将环脂酸芽孢杆菌区分到种或株的水平,在盲测试验中可 100%预测环脂酸芽孢杆菌,显示了较好的准确性,同时缩短了检测时间。ATR-I R作为筛选方法可用于果汁加工业,但所需设备费用较高。Hamzah等将傅立叶变换红外 (FT-I R)光谱技术与多元统计方法相结合建立了鉴定和检测苹果汁中环脂酸芽孢杆菌的方法[17],实验结果表明,通过对主成分 (PCA)进行聚类分析能够明显区分环脂酸芽孢杆菌。

3.4 愈创木酚的测定方法

前文已提到,环脂酸芽孢杆菌在导致果汁腐败时会产生特殊的气味,其主要成分为愈创木酚 (2-methoxyphenol)。利用愈创木酚具有挥发性的特点,可采用传感器、分析和化学等方法进行检测。

3.4.1 传感器方法

最好估测阈值 (best estimated threshold,BET)是反映传感器灵敏度的关键指标,在对水和果汁中愈创木酚的气味测定方法研究中,早期的 BET较低,仅为 13.00×10-9和 21.00×10-9,近期 siegmund报道了检测苹果汁中愈创木酚的 BET为 0.57×10-9[18],这是迄今为止利用传感器检测苹果汁中愈创木酚最为灵敏的报道。研究发现,检测灵敏度产生较大差异的原因,除传感器本身因素以外,不同基质对检测灵敏度的影响范围约 500倍[18]。随着技术的不断发展,电子鼻已用于软饮料中环脂酸芽孢杆菌的测定[19]。

3.4.2 分析方法

在利用高效液相色谱法 (HPLC)、气相色谱法(GC)检测愈创木酚的研究中,样品提取与制备方法有多种,顶空固相微萃取法 (HS-SPME)是目前一项通用的萃取技术。气相色谱仪常常与其他检测系统如火焰电离探测器 (GC-FI D)、嗅觉测量器、质谱仪 (MS)联用。鉴于质谱仪的特异性、精确度、高灵敏度的特点,GC-MS得到广泛使用。Zierler建立了苹果汁中酸土环脂酸芽孢杆菌 (A.acidoterrestris)产生的愈创木酚和 2,6-二溴苯酚 (2,6-DBP)的 HS-SPME GC-MS[20],通过优化参数,该方法对二者的检测限为 0.29μg/L和 0.08μg/L;定量限为 1.06μg/L和 0.27μg/L,但是目前的方法缺乏愈创木酚或卤酚与环脂酸芽孢杆菌之间的数量对应关系。

3.4.3 化学方法

通过过氧化物酶试验可以用来确定分离菌株从香草酸中产生愈创木酚的能力。除已知的 A.acidoterrestris,A.herbarius,A.herbarius外,并不是所有的环脂酸芽孢杆菌菌株均有产生愈创木酚的能力,试验结果会随着接种量和菌种进行变化。因此,在试验过程中需分别设置阳性对照和阴性对照,如 A.acidoterrestris,A.acidocaldarius与被测分离物在同等条件下进行测试,如果结果不确定,加大接种量或延长培养时间重新进行检测[11]。

4 环脂酸芽孢杆菌的控制技术

对环脂酸芽孢杆菌芽孢和菌体的抑制包括普通方法和特殊方法。过去将化学药品与热加工工艺结合使用被认为是抑制环脂酸芽孢杆菌芽孢的有效方法,然而,随着人们绿色消费观念的转变,目前已逐渐从使用化学药品转向使用合成添加剂和无害的成分。

4.1 普通方法

4.1.1 有机酸和苯甲酸钠

Hsiao和 Siebert研究了常用有机酸的抗 A.acidoterrestris的效果,实验表明效果依次是苯甲酸、奶油中提取的羊脂酸、乙酸、柠檬酸 -苹果酸 -乳酸-酒石酸[21]。由于该菌要求的酸性 pH生长条件能增强苯甲酸钠的抑菌效果,因此 Bevilacqua建议使用的浓度为 0.1-0.5g/L[22]。

4.1.2 氧化剂·Nisin·溶菌酶

多种氧化剂对A.acidoterrestris芽孢具有抗菌效果[23],抗菌效果依次为 NaOCl-H2O2＞NaCl O2＞Na3PO4。FDA允许使用 ClO2(50-200×10-6)作为洗涤水果和蔬菜的消毒剂,但用于苹果表面则效果较差;Lee等提出使用 ClO2气体作为消毒剂,并且用低浓度、中等浓度和高浓度的 ClO2气体进行了实验,处理 1h后,低浓度 (0.3mg/L)减少了初始芽孢2.7个对数值;中浓度 (1.78mg/L)和高浓度 (4.32 mg/L)的效果更为显著,减少了 5个对数值[24]。

Nisin是一种乳酸链球菌素 (亦称乳链菌肽)的天然生物活性抗菌肽,对革兰氏阳性菌表现出广谱抑菌效果,近年来被作为一种天然防腐剂而用于食品工业。该抗生素可直接添加到果汁中抑制 A.acidoterrestris及其芽孢的生长,用量范围为 1.25-100 I U/mL,效果取决于介质的 pH、果汁的种类以及固形物的成分。Nisin对芽孢的效果比对菌体的作用效果更好一些,原因是 Nisin的存在增加了芽孢对热的敏感度[25]。

溶菌酶对许多细菌有效,A.acidoterrestri也会受到溶菌酶的强烈影响 (0.25-2.0g/L),而且芽孢比菌体更敏感。实验表明,在溶液中加入溶菌酶后,检测不出环脂酸芽孢杆菌的芽孢,但是芽孢所处的介质也影响溶菌酶的生物活性[26]。

4.1.3 甘油单月桂酸酯·壳聚糖·香精油

Altieri等研究了低剂量的甘油单月桂酸酯对A.acidoterrestri的作用效果。在将麦芽浸粉肉汤的pH调整到 4.5时,测量了 A.acidoterrestri的生长情况,发现甘油单月桂酸酯对 A.acidoterrestri的菌体影响效果更明显,根据延长的细菌停滞期推断出减少的细菌生长指数最高为 48%,但相同的活性浓度对芽孢则没有同样的效果。

小分子量壳聚糖 (50-190kDa,75-85%脱乙酰度)对 A.acidoterrestri也具有抑制效果,培养基中最佳加入量为 1.4g/L,如果数量再低则对芽孢萌发没有效果[27]。

Takahashi等试验了用桉 (树)属植物的叶子提取物和黄酮类化合物抑制 A.acidoterrestri的效果,发现最小抑制浓度的范围为 7.8-31g/L。然而香精油的成分组成变化较大,主要取决于提取的方式、植株本身的差异以及生长的气候条件,因此,抑制A.acidoterrestri的有效成分应当是香精油的活性成分,活性成分的功效依次为肉桂醛、丁香酸、柠檬油精[28]。

4.2 特殊方法

热加工工艺作为唯一控制酸性饮料中的A.acidoterrestri以及抑制其芽孢萌发的方法已研究很长一段时间了,普遍采用的技术如下。

4.2.1 高静液压技术和高压均质技术

高静液压技术用于 A.acidoterrestri芽孢及菌体的灭活已被许多专家广泛建议使用:50℃,分别在350和 450MPa压力通过热处理,菌体可减少 3.53和 4.73个对数值,热处理效果严格受到温度和时间的影响。芽孢灭活通常分为两个阶段,第一阶段是如何减少芽孢萌发,第二阶段是如何使已萌发的芽孢灭活。由于果汁加工过程中经过了巴氏杀菌,因此在果汁中能够生存的就是A.acidoterrestri的芽孢。一种可供选择的方法是将高静液压技术与其他无害但可以有效抑制芽孢萌发的物质结合使用,在减少芽孢萌发的情况下,以较低的压力破坏菌体细胞[29]。

高压均质技术也被运用于抗 A.acidoterrestri及其芽孢的研究当中,实验显示,500-1700bar的压力范围,可以明显减少 1-2个对数值的试验初始菌数[30]。

4.2.3 辐照和微波技术

Nakauma等应用辐照 (电子束和伽马射线)结合传统的热处理工艺对灭活 A.acidoterrestri芽孢进行了研究。通常如果经过热加工处理,芽孢会迅速较少大约 1-1.5个对数值,但是到了第二阶段,则不能全部杀灭高抗性的芽孢。如果将辐照技术与传统热处理方法结合使用,由于辐射加快了芽孢的热休克,因此就可以减少热处理时间,如 95oC下达到减少芽孢 4个对数值的时间是 188min,经 2.0kGy剂量辐照后,达到同样效果的热处理时间就可以缩短到 23min[31]。

微波也可用于抑制细菌芽孢形成,研究者将 A.acidoterrestri接种在含橄榄油的芦荟膏状物中,在 80-100%强度 (2450MHz-900)加工 5-7min,A.acidoterrestri的芽孢数量可减少 2个对数值[32]。

5 结语

在检测方面,尽管目前细菌的分离鉴定方法有多种,不同原理采用的方法均有各自的特点,但就A.acidoterrestri而言:①传统分离方法根据其独特的生物学特性,仅依靠在低 pH上是否能够生长进行判断,既不如生化反应等鉴别手段便捷,试验数据似乎也不够充分,况且,除该类菌外是否还有其他菌能够在特定的培养基上生长,尚是个未知数。②虽然通过愈创木酚实验可以确证,但是不同菌株之间的差异或并非全部环脂酸芽孢杆菌都产生愈创木酚会使结果出现偏差,此外,整个实验所需时间较长也是一大弱点;传感器或仪器方法尽管较快,但是,对不产生愈创木酚、二溴苯酚的同类菌株则无法探测,因为该属中虽然主要是 A.acidoterrestri产生上述物质,但如果该属其他菌繁殖,也会导致果汁产生沉淀,同时,就污染源而言,也预示着存在产生腐败气味菌株的可能。③利用分子生物学原理进行最终的鉴定也许是目前较为实用的方法。④如果对传统方法进行改进,比如利用细菌产生的特异性酶,将增加方法的保险系数;另外利用分子生物学方法对其进行分型,对污染源的控制将会起到更好的作用。尽管研究集中在 A.acidoterrestri这一种菌上,但极有可能还存在导致果汁腐败的其他菌种。

在控制方面,尽管控制果汁中腐败菌的方法有多种,但目前大部分均限于实验室规模,进入实用性阶段尚有一段距离。就目前的研究结果而言,任何单一方式均存在一些缺陷,普遍问题就是不能做到全部杀灭 A.acidoterrestri,尤其是该菌形成的芽孢。多种方法协同使用并根据生产企业自身条件,才能最大程度消除果汁的腐败的微生物。

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