食物过敏原检测方法研究进展

陈颖 王玮,2

(1.中国检验检疫科学研究院 北京 100123;2.中国农业大学食品学院)

1 前言

食物过敏是一种人体对食物中抗原物质产生的由免疫介导的不良反应,严重时可能产生过敏性休克,甚至危及生命,目前已成为全世界关注的公共卫生热点问题[1]。据统计,全世界约有 2%-3%的成年人和 5-8%的儿童患有食物过敏症,其中90%以上的食品过敏来自小麦、花生、大豆、坚果类、牛奶、鸡蛋、鱼和甲壳类食物[2]。随着食品工业的迅速发展,人们的饮食习惯和食品种类发生了很大变化,因食品致敏的患者数量也日益增多,越来越影响到人类的生活质量和生命安全。为保障公众健康,很多国家和地区先后出台了相关的法律法规,要求明确标签、标识食品中的过敏原成分。食品法典委员会 (CAC)关于食物过敏标识的问题,在《预包装食品标识法典通用标准》中要求,对于所有已知可导致过敏反应的食品和配料都应加以说明。欧盟公布第 2003/89/EC号指令规定食品标签必须列明多类致敏成分,要求成员国从 2005年 11月 25日起禁止销售不符合标签规定的产品。美国自2006年 1月 1日起已开始实施新的强制性的《食品过敏原标识和消费者保护法规》(FALCPA),要求食品标签上必须标识致敏原成分种类,并规定了标识方式;对于含有未声明过敏原的食品,美国 FDA要求召回。日本厚生省《食品卫生法》规定必须清楚标示蛋、牛乳、小麦、荞麦及花生等 5种主要致敏原成分。香港地区从 2007年 7月 9日开始执行过敏原标识制度《食品及药物 (成分组合及标签)规例》,强调了对于甲壳类鱼类等水产品、花生和坚果的过敏原标识。我国在 2008年奥运会期间编制了《奥运会食品安全食品过敏原标识标注》,首次出现了对过敏原标识的要求,但该标准却随奥运会的结束而终止。2010年我国根据《食品安全法》规定和国务院有关部门建议,借鉴国外发达国家的对过敏原标识的管理办法,修订现行 GB/T23779-2009预包装食品中的致敏原成分,增加食物过敏原标示要求。

由于由于发达国家对进口食品过敏原标识越来越严格的要求,食物过敏原甚至成为国际食品进出口贸易壁垒的新手段。为保证过敏原标签、标识制度的实施,各国研究者纷纷开展了针对过敏原检测方法的研究。本文针对目前常见的两类检测方法——免疫学检测方法和核酸检测方法的研究进展进行综述和分析。

2 针对过敏蛋白的免疫学检测方法

引起食物过敏的主要成分是分子量介于 10000-70000之间的蛋白或糖蛋白,针对这类蛋白的检测主要采用免疫学检测方法,包括放射过敏原吸附抑制实验 (RAST)、酶标记过敏原吸附抑制实验(EAST)、火箭免疫电泳 (R IE)、免疫印迹法 (I B)和酶联免疫法 (EL ISA)等。

2.1 RAST或 EAST

RAST或 EAST主要应用于食物过敏的临床诊断,同时也应用于食物过敏原的定性检测及多种食物中潜在致敏性的评价。RAST/EAST的检测原理是抗原在固相载体上与特定人群血清中的 IgE结合,样品中的抗原与固定相上的抗原竞争结合 IgE,加入一种抗 IgE的同位素或酶标记抗体,并加入可改变颜色或者能发光的底物用于检测结合 IgE的抗体。此两种方法的弊端主要在于无法获取过敏人群的血清,评价方法的标准化较为困难。

2.2 RIE

R IE使用含有抗体的凝胶,被检测分析的抗原根据自身的电泳能力在凝胶中迁移直至抗体与抗原结合,所形成的电泳峰高与待检抗原含量成正比例。该法的局限在于凝胶的制备及免疫环节的操作步骤比较繁琐。

2.3 IB

IB主要用于半定量检测食物样品中的过敏蛋白,首先提取样品蛋白喷洒于硝酸纤维素膜或 PVPF膜上,用酶标记抗体与目标抗原进行结合反应,酶与底物反应显现出有颜色的斑点,斑点的深浅与抗原的含量成比例。

2.4 EL ISA

EL ISA法是用特定的蛋白或者抗原与特定的酶标记抗体结合后用显色反应来定性和定量,与前述方法相比 (R IE和 I B方法是定性和半定量方法,RAST和 EAST是定量分析方法),它因其准确性高、操作简便及标准化的可能性,常用于食品安全和临床检验等领域。EL ISA方法检测食物过敏原的方式主要有竞争 EL ISA和夹心 EL ISA方法两种。例如,国外研究者利用固相载体上的抗体捕捉过敏原,然后用酶标记的二抗形成夹心抗,检测腰果特异性蛋白,检测灵敏度可达 1.0μg/g,但其他坚果类如美洲山核桃、胡桃、开心果和葵花籽之间却存在着交叉反应,限制了 EL ISA法的应用范围[3]。EL ISA方法在检测虾过敏原时,利用原肌球蛋白特异性抗体,检测限为 2.5μg/g,但虾与龙虾、蟹等其他甲壳类之间却存在着显著的交叉反应[4]。脊椎动物原肌球蛋白虽与虾原肌球蛋白几乎存在 55%的同源性,但虾与含有原肌球蛋白的鸡和猪等脊椎动物却无交叉反应[5]。近年国内研究者建立了检测牛乳中β-乳球蛋白的间接竞争 EL ISA法,检测限范围在 0.05-1.00μg/mL之间[6]。还有些研究者利用双抗体夹心 EL ISA法分别检测食物中大豆、牛奶、虾及花生过敏原蛋白成分,其最低检测限分别为 100 ng/mL[7]、25 ng/mL[8]、40 ng/mL[9]和 8 ng/mL[10]。

随着试剂生产技术的发展和标记物的应用,检测食物过敏原的商业化试剂盒也应运而生,EL ISA试剂盒可检测和定量食物中过敏原成分,如花生蛋白 (0.1-5μg/g)、榛子蛋白 (1-10μg/g)、小麦蛋白(1.5-10μg/g)和大豆蛋白 (1-5000μg/g)等。然而 EL ISA试剂盒在检测鱼过敏原时,虽可检测出鱼释放的组胺成分,但并不适用于鱼过敏原蛋白的检测[11]。

EL ISA方法的特异性和灵敏性主要依赖于抗体识别食物过敏原,但食品工业常利用热处理、焙烤和酶解等深加工技术,这些技术可使过敏原蛋白发生变性和降解,而蛋白质结构的改变又可干扰蛋白提取物或抗体结合部位,会导致假阴性结果的出现。此外,对于某些过敏原,由于缺少特异性的单克隆抗体,无法利用 EL ISA法进行检测。

3 针对致敏食品的核酸检测方法

多聚酶链式反应 (PCR)技术起始于 20世纪 90年代中期,但食物过敏原的 PCR检测法凭借自身显著的优势,已逐渐取代 EL ISA法成为官方的食品安全检测机构或实验室的主流检测方法[11]。PCR法主要又可分为普通凝胶 PCR和荧光定量 PCR两种。普通凝胶 PCR技术检测结果只是定性方法,但可利用合适的内标物,进行半定量检测分析;而荧光定量 PCR法因其整个反应过程在密闭管中进行,无需反应结束后的电泳分析,因此可降低反应的污染率,这样利用荧光定量 PCR法代替普通 PCR法进行多种基因的检测越来越普遍。

与免疫学方法相比,PCR技术可通过引物优化和基因靶序列的合理选择来克服交叉反应的影响。对于缺乏特异性单抗的过敏原,PCR法可利用已知过敏原的基因序列实现检测。例如,Christine Hupfer等基于芹菜管家基因 Mtd,建立实时荧光PCR技术检测食物中的芹菜成分,检测限可达 5-10μg/g[12]。 I.Lo′pez-Calleja等利用 PCR技术扩增线粒体 12S rRNA基因,从绵羊和山羊奶酪中检测出了牛奶成分,检测灵敏度为 1.0%[13];还从水牛奶 (water buffalo milk)和意大利干酪中检测出了牛奶 (cows′milk)成分 ,检测灵敏度为 0.1%[14]。Rene′Ko¨ppel等利用榛果过敏原 Cor a 1基因、花生过敏原 Ara h 2基因、大豆内源基因 Lectin、牛线粒体 tRNA-Lys基因、鸡转化生长因子β-3基因等,建立多重实时荧光 PCR方法,从食物中检测出致敏性食物榛果、花生、大豆、牛和鸡等成分,实验结果显示出较好的特异性和灵敏性 (0.01%)[15]。此外,Françoise Nau等利用线粒体细胞色素 b基因设计特异性引物进行 PCR扩增,从鸡蛋制品中可分辨出火鸡蛋、鸭蛋和珍珠鸡蛋成分[16]。而鉴定鱼种类的 PCR方法主要是利用线粒体 DNA,尽管 5S r DNA、12S rRNA、16S rRNA及运铁蛋白等基因也能达到鉴定效果,但现普遍采用线粒体细胞色素 b基因进行鱼类物种鉴定[17]。

针对含麸质的谷类成分,R′emiAlary等运用定量 PCR方法,通过扩增普通小麦嘌呤吲哚蛋白 (puroindoline-a)基因和硬粒小麦脂质转移蛋白 (Lipid transfer protein)基因,从栗子粉中检测出谷类作物;Daniela Zeltner利用小麦高分子量麦谷蛋白 (HMW Glutenin B1-1)基因、黑麦 HMW Glutenin R-1基因和大麦醇溶蛋白(Hor 3)基因设计特异性引物和探针,建立了实时荧光 PCR法检测食物中的麸质谷物方法[18]。国内研究者栾凤侠等利用小麦过敏原基因 (γ-醇溶蛋白基因)设计特异引物和探针,通过实时荧光 PCR法从食品中检测出小麦成分[19]。曹际娟等选择大麦管家基因 Hordein、小麦管家基因Glmdin、黑麦管家基因 Secl和燕麦管家基因 Avenin作为物种鉴定的特异性标记基因,利用实时荧光PCR方法检测出食品中含麸质的谷类大麦、小麦、黑麦和燕麦成分[20]。

此外,PCR方法还可减少生物学相近物种间的交叉反应和假阳性结果,研究者常利用大豆内源基因 Lectin、大豆主要过敏原 Glym Bd 30K基因和 Gly m Bd 28K基因进行 PCR扩增来检测大豆过敏原。研究还表明,选用 Gly m Bd 30K基因可增强大豆与其他豆科植物的鉴别能力[21]。还有研究者建立一种实时荧光 PCR法,通过扩增花生过敏原特征基因序列如 Ara h 2基因、Ara h 3基因和 Ara h 4基因,用于检测花生过敏原,且Ara h 3基因较其他两类过敏原基因,检测灵敏度更高[22]。Alexandra Ehlert等利用实时荧光 PCR方法扩增腰果主要过敏原 Ana o3基因,可特异灵敏地检测出食物中腰果成分,检测限可达 2.0μg/g[23]。

PCR法在食物过敏原检测方面虽具有特异性和灵敏性等优势,但 PCR法无法检测出过敏原蛋白,因此检测结果不能与食物的真正致敏性相关。并且食品在加工处理后对蛋白和 DNA的影响也存在着差异,某些加工程序可能致使蛋白和 DNA被分离,无法验证食物中是否真正存在过敏原蛋白。但PCR方法对于进出口食品中潜在过敏原可起到预警和快速检测作用,为进一步确认食物中是否存在过敏原提供参考。

4 EL ISA与 PCR方法的比较

目前,EL ISA和 PCR方法皆适用于小麦、大豆、榛子、谷物和花生等食物的检测,两者实验结果之间存在较好的相关性,并且有不同的适用检测对象[24]。

但 EL ISA方法因自身具有较低复杂度的特异蛋白识别位点,易受到食物基质中所含糖、醛等物质的影响,改变其免疫原性。如果标记蛋白或标记的抗原决定簇在食品加工后受到破坏,这可能导致实验结果的假阴性,而且用动物抗体检测的抗原决定簇无法真正地反映出过敏患者识别的过敏原决定簇。

PCR方法对于检测具有较低DNA含量的食物,如牛奶、鸡蛋蛋白、植物油或动物脂肪,尚存在一些问题。对于这些样品的检测,基于蛋白的 EL ISA也许比 PCR更为适用,同时又因 DNA不具有组织的特异性,PCR技术无法分辨鸡蛋和鸡肉、牛奶和牛肉之间的差异,导致实验结果的假阴性或假阳性。但 PCR法在复杂食品中过敏原的定量分析及物种鉴定方面,却具有其他方法无法比拟的优点,这使PCR方法在动植物源性食物过敏原检测方面,存在极大的优势,适合国际法规所要求的食品中痕量过敏原的检测原则。

5 展望

随着全球经济一体化和食品贸易国际化,食物过敏症问题逐渐受到各国的关注,食物过敏原检测迫切需要一种快速、准确、高通量的体外检测方法。目前针对致敏原的检测方法主要还是以蛋白和DNA为检测目标,然而,EL ISA方法检测食物过敏原依赖于过敏原蛋白和众多质量稳定的动物抗体;PCR方法以简单、确定的 DNA序列为基础,适用于复杂食品中过敏原的定量分析。但两种方法在处理较多样品时操作繁杂,无法解决多种过敏原的同时检测。

由于现代科学技术的发展,新型的检测技术层出不穷,其中普通基因芯片技术以其高准确性、高灵敏度、高通量的优势逐渐成为食物过敏原研究的热点。但是,基因芯片技术在核苷酸杂交反应之后还需通过专业的荧光扫描系统进行结果分析,这往往给仅配备简单实验仪器的一线实验室在使用上带来很多不便之处。可视芯片技术作为一种利用特异探针杂交产生肉眼可见信号的基因芯片技术,现已成功应用于转基因作物[25]和食源性致病菌[26]等方面的检测。该技术可对多种靶基因同时检测和鉴定,实验结果可以直接通过肉眼进行判定,无需昂贵的信号分析系统,同时还可满足检测精确度和灵敏度的要求,而且响应迅速,操作简便,成本低廉并能解决现场检测和在线检测问题[27]。因此,可视芯片技术的出现为食物过敏原的研究、分析及检测开辟了一个崭新的空间。

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