牛及牛奶中兽用激素类物质残留的现状分析

张鸿伟 张艺兵 林黎明 静平 蔡发 陈世山 汤志旭

(山东出入境检验检疫局 山东青岛 266002)

1 前言

激素是由体内特定器官产生、通过血液运输到其他器官、以极其微小的量来产生调节生物体代谢、平衡作用的生理化学物质的总称[1]。常见的兽用激素类物质主要包括甾体激素和非甾体类物质。甾体激素可根据其甾体母核的不同分为雄激素、雌激素、孕激素和糖皮质激素等,其中前 3类属于性激素,糖皮质激素属于肾上腺皮质激素;也可根据其来源分为内源性天然激素和合成 (包括半合成)类激素。合成的非甾体类物质如二苯乙烯类衍生物,包括己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚等。此外,植物源性的雷索酸内酯类雌激素类似物如玉米赤霉醇等通常也涵盖在兽用激素的范围内。

激素类物质在畜牧业生产中作为促生长剂应用已有相当长的历史,目前的使用方式主要有两种:一种是合并使用天然的内源性激素 (降低可能产生的副作用,增加同化效果,尤其是针对阉割后的动物),在国外这种复方的埋植剂或预混剂被称为“同化激素鸡尾酒”[2];另外一种是使用合成的激素类物质 (降低其激素样效应而增强其同化作用),如目前在牛养殖中使用的群勃龙是同化作用最强的合成类生长促进剂,其同化作用是睾酮的 8-10倍 (对雌性动物的效果更为明显)。由于激素类物质可增加骨密度、肌肉重量和红细胞,极其微量就可以产生非常显著的生长调节作用,大大提高经济效益,此外它还能提高饲料转化率和药理作用人工化 (如人为的抑制动物发情、增强食欲等)等,还有报道[3,4]称激素对肉质的嫰感参数如胶原的水平和溶解性等有影响。因此,无论是在允许或禁止使用激素类物质作为促生长剂的国家和地区,经济利益的驱动通常会导致激素类物质的滥用。

现阶段,兽用激素类物质的滥用加之超标签范围使用、不当使用 (未按使用说明书使用)以及药品黑市等均是造成兽用激素类物质在动物及其初级产品中残留的重要来源。因此,牛养殖业作为畜牧养殖业中的重要组成部分,兽用激素类物质的滥用以及残留也是一个不容回避的问题。

2 国内外法规关于兽用激素类物质的规定

根据实验室研究和流行病学的调查结果,激素类物质残留可以通过食物链 (动物体内残留)和环境残留 (饮用水及排泄物)对人和动物健康、社会和生态环境造成直接和潜在危害[2,5]。目前世界上许多国家和地区已经禁用了相关激素类物质或对其作出了严格的规定。

国内方面,自 90年代以来,农业部先后颁布了176号、193号、235号公告以及质检总局发布的第37号公告,先后禁用了包括己烯雌酚、玉米赤霉醇、醋酸甲地孕酮、甲基睾酮等在内的约 20余种激素类物质及其制剂,同时对牛组织和牛奶中的糖皮质激素如地塞米松、倍他米松等规定了明确的残留限量。国际方面,欧盟从 1988年起就禁用了这些物质用于食源性动物,在最新修订的 37/2010法规中对部分物质在牛组织和牛奶中规定了最低要求执行限;日本 2006年 5月 29日实施肯定列表制度后,对相关物质也重新作出了严格规定,规定的基质范围扩展到牛的体液 (如尿液、血液及胆汁),同时对其残留标示物的化学状态也作出了要求 (如规定了激素类药物葡糖甘酸和硫酸酯结合物的残留限量)。但是,目前仍有一些国家允许将同化激素 (特别是内源性激素)用于动物尤其是牛的促生长,如美国、加拿大、澳大利亚、新西兰等[6]。常用激素类物质有 17β-雌二醇、孕酮、睾酮、玉米赤霉醇、群勃龙乙酸酯和美仑孕酮乙酸酯,这些物质常常作为埋植剂用于牛的促生长,且目前多数商品化的埋植剂是“复方”制剂。埋植剂作为可以使用的促生长剂一方面有滥用的风险,另一方面其常见的“复方”组合给残留检测带来了较大挑战,因为“复方”制剂中单种物质的含量较低,其残留需要更高灵敏度和选择性的仪器才能检测,而且“复方”制剂中若混合使用内源性激素类物质,将使其残留分析更将困难。除了埋植剂外,目前也有将这些物质掺入饲料中给动物进行喂食的情况存在。

总体而言,目前国际上,欧盟和日本对兽用激素类物质的控制相对严格 (多数激素类物质被禁用),而美国、加拿大、澳大利亚、新西兰等国家则相对控制较松,但多数物质在牛组织及牛奶中规定了最大残留限量。

3 残留检测

有效监控激素类物质的残留一直是检测领域的一个热点和难点[7],因为在兽用激素类物质的残留检测中,目标化合物种类繁多、结构相似、理化性质与许多内源性成分相近,甚至其本身就是内源性物质,其残留浓度可能接近或稍高于生理水平,因此对结果评判的要求较高,需要有效的样品前处理过程和高灵敏度的分析设备来保证理想的分析灵敏度、选择性和专属性。

当前对于激素残留检测基质主要包括尿液、粪便、毛发、动物组织 (肝、肾、肌肉、脂肪 )、牛奶等 ,其中,在方法的选择上使用最多的是液相色谱 -质谱 /质谱,气相色谱 -质谱 /质谱、气相色谱 -高分辨质谱等[8-13]。由于激素类物质有内源性天然激素和合成类激素之分,因此在检测时对天然的内源性激素物质允许有“背景值 (天然水平)”的存在,但是对于合成类物质,理论上应当是零水平。

现阶段,激素类物质的非法使用有趋向于使用天然激素的倾向[14],因而在困扰激素类物质残留检测的各种因素中,值得提出的是内源性天然激素与外源性天然激素的区别检测,除了在化学本质上的高度一致外,内源性天然激素水平依据动物产品的类型、动物种类、性别、年龄、饮食、是否阉割或妊娠、是否有疾病、是否在治疗状态以及其他生理状况等均有变化[15],因此长期以来针对天然激素残留的结果评判一直是争议焦点。

近年来,随着技术手段的改进,目前已经可以进行激素内源性与外源性的区别检测:

(1)使用激素的代谢特征来进行区分。主要原理是分析天然激素的结合态和游离态的比率,并利用多元统计分析方法进行区分。

(2)使用气相色谱 -同位素比质谱 (GC-CIRMS)区分。该方法的主要原理是利用天然的内源性激素其 13C/12C的比例与合成的内源性激素的不同来进行测定的[7,13]。

尽管如此,由于激素类物质在动物生长的不同阶段呈现不同的表达水平,且内源性激素与合成类激素的区分也非绝对,如 Kenedy等[16]就发现受伤雄性牛的尿液中存在α-和β-诺龙残留,导致对于诺龙和勃地酮等物质有“半内源性激素”(在某些特定情况下生物体内产生)的称呼[17],所以对激素类物质的残留检测不像其他化学残留物,只是监控其残留标示物即可。激素残留检测应当在对激素的化学本质、生物转化和其在动物体内的代谢有着深入研究的基础上才能有合理的监控。

此外,由于复方埋植剂或同化激素鸡尾酒的存在,因此,激素类药物残留分析的一个重要趋势是“非目标物筛查”分析。这是基于激素类物质通常是通过受体发挥生物学作用,利用生物学原理结合现代分析技术就可对激素类残留进行非目标物筛查分析,Rijk[18]和 Houtman[19]等均通过此思路采用不同的技术途径实现了对激素类物质的“盲筛”。在激素类物质残留检测方面另一个值得提出的动向是要加强激素类物质代谢产物的检测,因为激素类物质的代谢产物其作用活性有时不亚于母药本身甚至更强[20],它们同样可以对人类和动物的健康造成潜在的危害。

4 小结

激素类物质在牛及牛奶中的残留已经直接或间接地对人类的健康造成了危害风险,应当采取更加科学和严格的措施来控制其残留。在目前的技术条件下,使用筛选方法筛出的内源性激素残留,再通过代谢组学方法或 GC-C-I RMS做进一步的确证分析以进行合理的结果判定是较为有效的分析途径。另外,加强对激素类物质生物转化和代谢的研究,建立高效的非目标物筛查及代谢产物检测的方法将是未来兽用激素类物质残留分析研究的重要方向。

[1] 孙胜龙.环境激素与人类未来[M].北京:化学工业出版社,2005:3.

[2] 李俊锁,邱月明,王超.兽药残留分析[M].上海:上海科学技术出版社,2002:578.

[3] CrossH R,Schanbacher B D,Crouse J D.Sex,age and breed related changes in bovine testosterone and intramuscular collagen[J].Meat Sci,1984,10:187-195.

[4] Gerrard D E,Jones,Aberle E D,et al.Collagen stability,testosterone secretion and meat tenderness in growing bulls and steers[J].J Anim Sci,1987,65:1236-1242.

[5] European Commission.Proceedings of European workshop on the impact of endocrine disruptors on human health and wildlife[R].Weybridy,UK,1996.

[6] GentiliA,SergiM,PerretD,et al.High-and low-resolution mass spectrometry coupled to lliquid chromatography as confirmatory methods of anabolic residues in crude meat and infant foods[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2006,20:1845-1854.

[7] Scarth J,Akre C,van Ginkel L,et al.Presence and metabolism of endogenous and androgenic-anabolic steroids hormones in meat-producing animals:a review[J].Food Addit Contam:Part A,2009,26:640-671.

[8] George K,Georgios T,ThemistoklisD.Determination of anabolic steroids in bovine urine by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B,2009,877:2330-2336.

[9] Nielen M W F,Rutgers P,van Bennekom E O,et al.Confirmatory analysis of 17 beta-boldenone,17 alpha-boldenone and androsta-1,4-diene-3,17-dione in bovine urine,faeces,feed and skin swab samples by liquid chromatography-electrosprayionisation tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B,2004,801:273-283.

[10] RambaudL,Monteau F,Deceuninck Y,et al.Development and validation of a multi-residue method for the detection of a wide range of hormonal anabolic compounds in hair using gas chromatography-tandem mass spectrometry[J].Anal Chim Acta,2007,586:93-104.

[11] Ahmadkhaniha R,Shafiee A,RastkariN,et al.Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle’smeat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach[J].Anal Chim Acta,2009,631:80-86.

[12] Yang Y,Shao B,Zhang J,et al.Determination of the residues of 50 anabolic hormones in muscle,milk and liver by very-high-pressure liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B,2009,877:489-496.

[13] European Food Safety Authority.Opinion of the scientific panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission related to hormone residues in bovine meat and meat products[J].The EFSA J,2007,510:1-62.

[14] Courtheyn D,Le Bizec B,Brambilla G,et al.Recent developments in the use and abuse of growth promoters[J].Anal Chim Acta,2002,473:71-82.

[15] European Commission Health and Consumer Protection DG..O-pinion of the scientific committee on veterinary measures relating to public health assessment of potential risks to human health from hormone residues in bovine meat and meat products[R].1999.

[16] Kenedy D G,Shortt H D,Crooks S R H,et al.Occurrence ofα-andβ-nortestosterone residues in the urine of injured male cattle[J].Food Addit Contam:Part A,2008,26:683-691.

[17] Noppe H,Le Bizec B,Verheyden K,et al.Novel analytical methods for the determination of steroid hormones in edible matrices[J].Anal Chim Acta,2008,611:1-16.

[18] Rijk J,Bovee T F H,Wang S,et al.Detection of anabolic steroids in dietary supplements:The added value of an androgen yeast bioassay in parallel with a liquid chromatography-tandem mass spectrometry screening method[J].Anal Chim Acta,2009,637:305-314.

[19] Houtman C J,et al.Detection of anabolic androgenic steroid abuse in doping control using mammalian reporter gene bioassays[J].Anal Chim Acta,2009,637:247-258.

[20] Noppe H,Le Bizec B,Verheyden K,et al.Novel analytical methods for the determination of steroid hormones in ediblematrices[J].Anal Chim Acta,2008,611:1-16.