脑红蛋白在糖尿病大鼠视网膜中的表达

许星照 华飞 冯建国 谈炎 刘瑶

·基础研究·

脑红蛋白在糖尿病大鼠视网膜中的表达

许星照 华飞＊冯建国 谈炎＊＊刘瑶

目的探讨脑红蛋白(NGB)在糖尿病大鼠视网膜中的表达与分布。方法将SD大鼠随机分为对照组和糖尿病组。糖尿病组大鼠采用链脲佐菌素一次性腹腔内注射建立糖尿病模型。定期处死大鼠，应用免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜组织中NGB的表达变化。结果糖尿病大鼠视网膜中的NGB分布逐渐增加后趋于稳定。结论NGB在糖尿病大鼠视网膜表达较对照组明显增加，提示NGB可能在糖尿病状态下为视网膜神经细胞供氧，减轻糖尿病视网膜缺氧造成的损害。(中国眼耳鼻喉科杂志，2011，11：90-91)

脑红蛋白；糖尿病视网膜病变；免疫组织化学

脑红蛋白(neuroglobin ，NGB)主要定位于脊椎动物脑和视网膜中[1]，其功能还未完全确定。目前发现缺血低氧诱导NGB在神经组织中表达增高，显著提高神经细胞抗缺氧的能力[2]。有研究发现，常态下视网膜中NGB的含量是大脑中的100倍，占整个视网膜总蛋白量的2%～4%[3]。

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的严重并发症，可导致不可逆的视力丧失。DR的原因可能是糖尿病状态下局部血流减少，导致组织缺氧造成神经细胞损害。本研究通过建立大鼠糖尿病模型，应用免疫组织化学技术检测NGB在不同时间视网膜中的表达情况,探讨NGB在糖尿病视网膜中的表达。

1 材料与方法

1.1 模型制备 40只SD大鼠，适应性喂养1周后随机分20只大鼠为实验组，20只为正常对照组。实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ，40 mg/kg体质量)，对照组注射柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L、pH=4.5)，注药后72 h测血糖。实验组大鼠血糖均超过16.7 mmol/L，造模成功。将实验组大鼠随机分为糖尿病2、4、6和 8周组，每组5只。分别于各时间点将对应组动物处死，取出眼球备用。

1.2 组织切片及苏木素-伊红(HE)染色 腹腔注射l%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，快速开胸；从左心室插管至升主动脉，剪开右心耳；先用生理盐水(约为动物体重的35%)快速灌注，后续以含4%的多聚甲醛0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS，pH=7.4)；灌注量为生理盐水的4倍；灌注结束后立即取出大鼠双侧眼球，去除眼前节投入固定液中，固定2 h；然后置入25%的蔗糖PBS中，4 ℃过夜至沉淀。最佳切削温度(optimal cutting temperature,OCT)包埋剂包埋眼球，恒冷箱冷冻切片机-20 ℃连续矢状切片。片厚8 μm，贴附于载玻片上，-80 ℃冰箱冻存，准备进行HE染色及免疫组织化学染色。

1.3 NGB染色及结果判定 免疫组织化学染色：切片取出后经室温平衡，用冷丙酮固定，晾干。PBS冲洗，0.3% H2O2室温浸泡10 min；PBS冲洗，滴加NGB抗体，4 ℃过夜；PBS冲洗3次， 每次3 min，滴加二抗，室温孵育1 h；PBS冲洗3次，每次3 min；二氨基联苯胺显色， 显微镜下控制染色强度。苏木素复染，水洗后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察结果。在200倍显微镜下观察切片，视网膜NGB阳性表达物为棕黄色颗粒。

2 结果

2.1 血糖及HE染色 对照组大鼠血糖始终处于正常值范围，实验组大鼠血糖在STZ诱发的第3 天起至实验结束均大于16.7 mmol/L。对照组大鼠体重逐渐增加；实验组大鼠在血糖增高后出现多饮、多食、多尿，体重无增加，部分明显消瘦，出现个别大鼠死亡。

光镜下正常对照组大鼠视网膜各层细胞排列整齐，细胞形态正常；实验组可见视网膜节细胞层及内核层水肿，细胞排列紊乱。

2.2 免疫组织化学检测 正常对照组视网膜NGB主要表达于内丛状层、外丛状层和光感受器内节，在视网膜其他层很少表达(封三图1)。在糖尿病诱导成功2周，视网膜组织中发现NGB阳性颗粒增加(封三图2)；糖尿病4周时，NGB阳性颗粒明显增加(封三图3)；6周时，NGB阳性颗粒达到高峰(封三图4)；8周时，趋于稳定(封三图5)。这些增加的阳性颗粒主要位于糖尿病大鼠视网膜的内丛状层、外丛状层和光感受器内节，而在视网膜其他层很少表达。

3 讨论

糖尿病视网膜病变是糖尿病视网膜并发症。高血糖使红细胞携氧能力减弱，使糖基化血红蛋白在血红蛋白中的比例增高，氧不易扩散至组织中；使毛细血管基底膜增厚，从而引起视网膜组织慢性缺血缺氧，进而造成组织损伤[4]。在2～4 周，糖尿病大鼠视网膜中即可发现局部血流减少[5]；眼局部应用血管扩张剂后可以减轻糖尿病视网膜病变表现，说明缺血缺氧在糖尿病视网膜损伤中的重要作用。

NGB在氧代谢方面有类似肌红蛋白的功能，NGB和氧具有较高的亲和力,储存氧气和促进氧气向线粒体扩散或直接介导氧气向线粒体传递，促进ATP的产生，从而维持正常神经元的功能[6]。正常大鼠视网膜中的NGB主要分布在内丛状层、外丛状层和光感受器细胞内节[3]，这3层是高耗氧层。在光感受器细胞内的亚细胞定位显示，NGB主要位于线粒体最集中的区域——顶部内节的椭圆体区[7]，可见视网膜 NGB的分布和功能与线粒体耗氧有着直接或间接的联系。有学者[2]发现NGB具有清除一氧化氮(NO)的功能， 参与NO的代谢过程，从而减少NO对线粒体的损伤，并且保护神经元细胞来抵抗氧化应激。最近，Rajendram和Rao[8]等通过免疫荧光和电镜技术检测末期青光眼患者的视网膜切片发现，患者视网膜的内丛状层、外丛状层和光感受器内节以及核层NGB表达增强，而在视网膜其他层很少表达。

实验组大鼠视网膜组织中，NGB的表达高于对照组，表明糖尿病大鼠视网膜有缺血缺氧损伤，可诱导NGB表达升高。Sun等[2,9]发现，细胞低氧信号转导途径参与NGB基因表达的调控，低氧能使NGB基因表达增强。推测实验组糖尿病大鼠视网膜缺氧，细胞低氧信号转导途径处于激活状态，NGB表达量随着糖尿病的病程延长增多。我们认为，NGB在缺氧状态可能为视网膜神经细胞提供氧，减少氧化应激，保护神经元，减轻糖尿病视网膜缺氧造成的损害。

本研究结果发现，糖尿病诱导2周视网膜组织中即发现NGB阳性颗粒少量增加，4周时明显增加，8周时趋于稳定。显示随着糖尿病病程延长，NGB阳性颗粒数量增加后趋于稳定，提示在糖尿病视网膜病早期，视网膜可通过增加NGB的供氧来减轻视神经细胞的损害；而在中后期，随着糖尿病视网膜病变进展，NGB的表达可能已经饱和，不能有效减缓糖尿病视网膜病变的进程。当然，对于NGB在糖尿病视网膜病变中的作用，尚值得进一步探索。

[1]Burmester T,Weich B,Reinhardt S,et al.A vertebrate globin expressed in the brain[J].Nature,2000,407 (6803):520-523.

[2]Sun Y,Jin K,Mao XO,et al.Neuroglobin is up-regulated by and protects neurons from hypoxic-ischemic injury[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98 (26):15306-15311.

[3]Schmidt M,Giessl A,Lauft T,et al.How does the eye breathe? Evidence for neuroglobin-mediated oxygen supply in the mammalian retina[J].J Biol Chem,2003,278 (3):1932-1935.

[4]Ciulla TA,Harris A,Latkany P,et al.Ocular perfusion abnormalities in diabetes[J].Acta Ophthalmol Scand,2002,80 (5):468-477.

[5]Mondal LK,Baidya KP,Bhattacharya B,et al.The efficacy of topical administration of brimonidine to reduce ischaemia in the very early stage of diabetic retinopathy in good controlled type-2 diabetes mellitus[J].J Indian Med Assoc,2004,102 (12):724-725,729.

[6]Geuens E,Brouns I,Flamez D,et al.A globin in the nucleus![J].J Biol Chem,2003,278 (33):30417-30420.

[7]李耀宇,刘惠玲,童绎，等.脑红蛋白在大鼠眼球中分布的免疫组化学研究[J].眼科研究,2006,24 (5):461-464.

[8]Rajendram R,Rao NA.Neuroglobin in normal retina and retina from eyes with advanced glaucoma[J].Br J Ophthalmol,2007,91 (5):663-666.

[9]Sun Y,Jin K,Peel A,et al.Neuroglobin protects the brain from experimental stroke in vivo[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100 (6):3497-3500.

2010-11-18)

(本文编辑 诸静英)

Expressionofneuroglobininretinaofdiabeticrats

XUXing-zhao，HUAFei＊，FENGJian-guo，TANYan＊＊，LIUYao.DepartmentofOphthalmology,AffiliatedThirdHospitalofSoochowUniversity，Changzhou213003，China

Corresponding author：Liu Yao,Email:jiahl2000@163.com

ObjectiveTo explore the neuroglobin ( NGB ) expression in retina of diabetic rats.MethodsThe SD rats were randomly divided into two groups：control group and diabetic group.Diabetes was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin ( STZ ) in diabetic group．The immunohistochemical techniques were used to detect the expression of neuroglobin ( NGB ) in retina of each group at different time.ResultsThe expression of NGB increased gradually in retina of diabetic rats,then the tendency to be stable.ConclusionsA considerable increasing expression of NGB were found in diabetic group compared to control group.The study hints that NGB may supply oxygen to the retinal neurons at the condition of diabetes,and lessen the injury due to hypoxia in the diabetic retina.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2011,11:90-91)

Neuroglobin； Diabetic retinopathy； Immunohistochemistry

苏州大学附属第三医院眼科＊内分泌科＊＊病理科常州 213003

刘瑶(Email：jiahl2000@163.com)