沙葱多糖除蛋白方法的研究

段伟伟 张兴夫 敖长金

沙葱（Allium mongolicum Regel）属被子植物门（Angiospermae），百合科（Liliaceae），葱属（Allium），学名蒙古韭，蒙古语称为“特那”，是一种生命力顽强的植物[1]。沙葱主要分布于新疆、青海、甘肃、宁夏、陕西、内蒙古、辽宁、蒙古西南部等地的荒漠草原和沙地[2]，其特点是抗寒、抗旱，适应能力强。多糖是一类天然高分子化合物，它由10个以上乃至几千个单糖以糖苷键相连形成的线型或支链的高聚物，一般多糖常由100个以上甚至几千个单糖基组成[3]。近几十年来，由于分子生物学的发展，人们逐渐认识到了多糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能，它在免疫功能的调节、细胞与细胞的识别和细胞间物质的运输等方面都发挥着巨大的作用[4-7]。由于沙葱多糖溶液中含有大量的蛋白质，这会对沙葱多糖的进一步分离和纯化造成影响，所以试验研究了Sevage法和三氯乙酸法去除沙葱多糖溶液中蛋白质的最佳工艺参数，并对这两种方法进行了比较，为沙葱多糖的进一步分离纯化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

沙葱采自内蒙古鄂尔多斯市鄂托克旗天然草场；无水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、浓硫酸、三氯乙酸、苯酚，均为分析纯，购于北京化工厂；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250购于呼和浩特市博奥试剂公司。

Sartorious BP221S电子天平；Unic2100可见分光光度计；SK-1型快速混匀器；低速大容量多管离心机。

1.2 试验方法

1.2.1 沙葱多糖提取

将烘干后沙葱用98%的工业酒精按1∶8的比例（烘干沙葱∶酒精）70℃脱脂1次，65℃烘干后按25∶1的水料比，80℃浸提8 h，抽滤弃去残渣后的多糖提取液经旋转蒸发仪浓缩到原体积的1/3，加等体积无水乙醇于4℃过夜，6 000 r/min离心30 min得沙葱粗多糖，冷冻干燥后称重，用蒸馏水配置成10 mg/ml沙葱粗多糖溶液待用。

1.2.2 多糖含量的测定

采用硫酸-苯酚法[8]。

葡萄糖标准溶液的配制：准确称取105℃下干燥至恒重的标准葡萄糖0.395 g于250 ml容量瓶中，加水至刻度，配得浓度为1.58 mg/ml葡萄糖母液，用移液管移取10 ml葡萄糖母液至100 ml容量瓶中定容至刻度，即得浓度为0.158 mg/ml的标准葡萄糖溶液。

苯酚溶液的配制:称取苯酚100.000 g，加0.1 g铝片和0.05 g NaHCO3进行常压蒸馏，收集（180±20）℃的馏分。精密称取该馏分6.000 g充分溶解于94.000 g去离子水中，转置于棕色试剂瓶中，即得6%苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。

标准曲线的绘制:分别吸取0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 ml，各以去离子水补至1.5 ml。之后加入6%苯酚溶液2.0 ml及浓硫酸6.5 ml，静置10 min，摇匀，置于40℃恒温水浴锅中30 min，取出后冷却10 min后于490 nm测定溶液吸光值，以1.5 ml蒸馏水按照同样显色操作为空白，横坐标为多糖溶液的浓度，纵坐标为光密度值得到标准曲线。

1.2.3 蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝法[9]。

牛血清蛋白标准溶液的配置：准确称取100 mg牛血清蛋白，溶于100 ml蒸馏水中，配置为1 mg/ml的原液。

考马斯亮蓝G-250的配置：称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml、90%的乙醇当中，加入85%的H3PO4100 ml,最后用蒸馏水定容到1 000 ml。

蛋白标准曲线的绘制：分别吸取牛血清蛋白原液20、40、60、80、100 μl，各以去离子水补置1 ml。分别加入5 ml配置好的考马斯亮蓝G-250。摇匀后静置2 min在595 nm下比色，记录下OD值。

1.2.4 Sevage法除多糖溶液中蛋白质的正交试验

采用3因素3水平正交试验设计，选择试剂添加量（A）、氯仿与正丁醇比（B）、振摇时间（C）3个因素。优化Sevage法除沙葱多糖溶液中蛋白质的工艺参数。正交试验的因素水平设计见表1。

表1 正交试验的因素水平设计

1.2.5 三氯乙酸法除多糖溶液中蛋白质的正交试验

高浓度的三氯乙酸会造成多糖溶液的大量损失，一般用于除蛋白的三氯乙酸浓度都在5%～30%，考虑到沙葱多糖的提取率不是很高，试验把三氯乙酸的用量范围设定在5%～15%，通过正交试验研究三氯乙酸除沙葱多糖溶液中蛋白质的最佳工艺参数。采用3因素3水平正交试验设计，选择三氯乙酸的浓度（A）、三氯乙酸添加量（B）、振摇时间（C）3个因素。正交试验因素水平见表2。

表2 正交试验的因素水平设计

2 结果与分析

2.1 多糖含量测定

标准曲线如图1所示:葡萄糖标准曲线线性回归方程为：y=8.834 2x-0.061 5，R2=0.999 8。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 蛋白质含量测定

蛋白曲线的线性回归方程为：y=0.007x-0.047，相关系数R2=0.999。标准曲线如图2所示。

Sevage法除蛋白正交试验以除蛋白率（K）和多糖损失率(T)为评价指标，试验的目的是找出除蛋白率最大而多糖损失率最小的工艺参数组合，综合考虑这两个因素，保证在多糖损失率最小的条件下除蛋白率最大。

图2 蛋白质标准曲线

2.3 Sevage法除多糖溶液中蛋白质的正交试验结果（见表3）

表3 Sevage法除蛋白正交试验结果

由表3的极差分析结果可知：影响Sevage法除沙葱多糖溶液中蛋白效果的主次因素为B(氯仿与正丁醇的比例)＞C(振摇时间)＞A(试剂添加量)，最佳的工艺组合条件为A2B2C2，即Sevage试剂添加量为沙葱多糖溶液体积的1/4，氯仿与正丁醇的比例为3∶1，振摇时间为25 min。影响多糖损失率的因素的主次程度为C(振摇时间)＞A(试剂添加量)＞B(氯仿与正丁醇比例)，多糖损失率最小的工艺组合为A2B2C3，即Sevage试剂添加量为沙葱多糖溶液体积的1/4，氯仿正丁醇的比例为3∶1，振摇时间为30 min。此时沙葱多糖的除蛋白率为43.82%，多糖损失率为4.67%。综合考虑除蛋白率和多糖损失率两个因素试验最后选用的工艺参数为A2B2C3。

2.4 三氯乙酸法除多糖溶液中蛋白质的正交试验结果（见表4）

表4 三氯乙酸法除蛋白正交试验结果

三氯乙酸法除沙葱多糖溶液中蛋白正交试验同样以除蛋白率（K）和多糖损失率(T)为评价指标。由正交表可以看出，影响三氯乙酸除蛋白的因素的主次程度为B(三氯乙酸添加量)＞A（三氯乙酸浓度）＞C(振摇时间)。三氯乙酸法除蛋白的最佳工艺组合为A3B1C3，即三氯乙酸的浓度为15%，添加量是沙葱多糖溶液体积的1倍即1∶1添加，振摇时间为20 min。此时的除蛋白率为87.33%，多糖损失率为55.59%。以多糖损失率为评价指标时，影响多糖损失率的因素的主次因素为B(三氯乙酸添加量)＞A(三氯乙酸的浓度)=C(振摇时间)，多糖损失率最小的工艺组合为A3B3C2，此时多糖损失率为21.45%。通过正交试验结果可知三氯乙酸除沙葱多糖溶液中蛋白时对沙葱多糖会造成很大损失。

3 讨论

要对沙葱多糖的组成、结构、功能进行测定分析，必须将沙葱多糖纯化。沙葱粗多糖中含有大量的结合蛋白和游离蛋白影响沙葱多糖的分离和提纯，所以在分离提纯前应该先去除溶液中的蛋白。Sevage法和三氯乙酸法都是除蛋白的有效方法，本试验结果表明两种方法各有优劣，Sevage法除蛋白率低但是多糖损失少，三氯乙酸法除蛋白率高但是多糖损失量大。方升平等（2009）[10]研究发现，Sevage法川芎对多糖溶液中蛋白质去除率高达90%以上，但多糖回收率仅为40%。三氯乙酸法对川芎多糖溶液中蛋白质去除率为37.28%，多糖回收率为73.19%。徐敏等（2007）[11]研究发现，Sevage法除蛋白操作复杂，多糖损失量大。三氯乙酸法除蛋白去除率高并且多糖损失量少。以上研究结果与本试验结果并不一致，分析原因可能是不同植物多糖溶液中结合蛋白和游离蛋白的含量相差很大。

4 结论

使用Sevage法去除沙葱多糖溶液中蛋白质的最佳工艺为：Sevage试剂添加量为沙葱多糖溶液体积的1/4，氯仿与正丁醇的比例为3∶1，振摇时间为30 min。在此条件下，沙葱多糖的除蛋白率为43.82%，多糖损失率为4.67%。

使用三氯乙酸法去除沙葱多糖溶液中蛋白质的最佳工艺为：三氯乙酸浓度为15%，与沙葱多糖溶液按体积比1∶1添加，振摇时间为20 min。此时的除蛋白率为87.33%，多糖损失率为55.59%。

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