棉粕发酵前后营养成分变化研究

金红春 兰时乐 胡毅 毛小伟 肖调义

随着水产饲料业的高速发展，鱼粉资源的不断枯竭，加上近年来国内外陆生养殖动物流行病害严重，动物蛋白源如肉骨粉、禽肉粉、血浆制品等的使用受到严重限制[1-4]。棉粕是我国除豆粕之外常用的替代鱼粉的植物蛋白源，因此棉粕的开发利用是解决我国蛋白质资源短缺的主要途径之一。作者在前人研究基础上采用由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)及酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等组成的复合菌固体发酵棉粕，生产棉粕蛋白饲料，通过单因素试验和正交优化试验，确定其最佳发酵工艺，试图找到一种不仅能避免化学添加剂和物理法对棉籽蛋白质功能性质的影响，还会改善适口性，提高蛋白质含量，既安全又可降低成本，具有很好发展潜力的一种有效方法，为棉粕发酵的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 发酵菌种

发酵菌种由湖南农业大学生科院实验室提供，粉末状固体，活菌数＞1010CFU/g。

1.1.2 发酵原材料

棉粕、麦麸由湖南湘北水产饲料有限公司提供，棉粕粗蛋白41.25%、淀粉酶活力580 U/g、脂肪酶活力260 U/g；麦麸粗蛋白16.46%,淀粉酶活力180 U/g、脂肪酶活力150 U/g。。

1.1.3 培养基

斜面培养基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%、琼脂1.5%～2.0%，pH值7.0～7.2，121℃灭菌25 min。

液体种子培养基[6]：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%、葡萄糖5%、pH值7.0～7.2，121℃灭菌25 min。

发酵培养基：棉粕、麦麸分别占发酵底物的80%、20%，葡萄糖2%，（NH4）2SO41%，固水比1∶0.5，pH值7.0。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种培养

菌种活化：将保存于冰箱的斜面种子接种于新鲜斜面培养基上，37℃恒温培养36 h。

液体种子培养：将培养36 h的斜面种子分别接种于液体种子培养基中，37℃，150 r/min条件下振荡培养18～24 h。

发酵培养：按5%的接种量（V/W）接种于装量为50 g/250 ml三角瓶发酵培养基中，混合均匀后，置于30℃恒温培养箱中培养5 d，培养过程中从培养开始每24 h摇动1次。

1.2.2 单因素条件研究

培养方法与1.2.1节相同，替换不同的条件，即棉粕与麦麸的比例、葡萄糖含量、（NH4）2SO4添加量、发酵温度、初始pH值、含水量、接种量、发酵时间、装量等，测定不同条件下各营养成分的变化情况。每处理3个重复。

1.3 测定及分析方法

1.3.1 蛋白质含量测定

全自动凯氏定氮仪（FOSS），kjeltecTM 2300。

1.3.2 淀粉酶活力的测定

采用顾赛红[7]报道方法，即3、5-二硝基水杨酸法测定。酶活定义为:在40℃条件下，每分钟催化可溶性淀粉水解生成1 μmol麦芽糖所需要的酶量为1个酶活力单位（U/g）。

1.3.3 脂肪酶活力的测定

采用张海燕[8]报道方法，即铜皂法测定。酶活定义为：在37℃条件下，每分钟催化脂肪水解产生1 μmol脂肪酸的脂肪酶量定义为一个脂肪酶国际单位(U/g)。

1.3.4 数据处理分析

试验结果使用SPSS17.0统计软件，Duncan氏多重比较检验均值的差异显著性,当P＞0.05时,表示差异不显著，当P＜0.05时,表示差异显著，结果用平均值(M)±标准误(SE)表示，用Excel 2000进行图表分析。

2 试验结果与分析

2.1 发酵培养基的筛选

2.1.1 棉粕与麦麸比例对发酵产物营养成分的影响

改变发酵培养基棉粕与麦麸的比例（100∶0；95∶5；90∶10；85∶15；80∶20；75∶25），30℃恒温培养5 d，发酵料低温烘干后，测定粗蛋白含量及淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶酶活（见图1）。

图1 棉粕与麦麸比例对发酵棉粕营养成分的影响

从图1可知，粗蛋白含量、淀粉酶活力、脂肪酶活力随培养基中麦麸比例增加而升高，当棉粕与麦麸的比例为90∶10时，达到最高，粗蛋白含量达到39.41%；淀粉酶活力746 U/g，与其他比例条件下相比达到最高；脂肪酶活力比发酵前的249提高了132 U/g，达到381 U/g。随后增加培养基中麦麸的比例，粗蛋白含量随之降低，两种酶活明显降低，因此，选择棉粕与麦麸的比例为90∶10。

2.1.2 葡萄糖含量对发酵产物营养成分的影响

按质量比在培养基中分别加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的葡萄糖，以不加葡萄糖为对照组，其它条件不变，见图2。

图2 葡萄糖含量对发酵棉粕营养成分的影响

从图2可以看出，发酵培养基中加入葡萄糖对粗蛋白含量的影响较大。培养基中随着葡萄糖含量增加，粗蛋白含量下降较快，对提高营养成分含量不利。葡萄糖含量对淀粉酶活力影响较小，但淀粉酶活力、脂肪酶活力都随添加量的增加而降低。因此，发酵过程中不需要在培养基中加入葡萄糖作为微生物生长的速效碳源。

2.1.3 硫酸铵含量对发酵产物营养成分的影响

分别在培养基中加入不同质量比的硫酸铵(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)，以不加硫酸铵为对照，见图3。

图3 硫酸铵含量对发酵棉粕营养成分的影响

从图3可以看出，在一定范围内，发酵培养基中随着(NH4）2SO4含量的增加，营养成分含量也随之增加。当发酵培养基中(NH4）2SO4含量为1%时，发酵产物中粗蛋白与不添加硫酸铵对照组的39.97%相比提高了0.58%，达到40.55%；淀粉酶活力比对照组748 U/g提高了103 U/g，达到861 U/g；脂肪酶与对照组相比提高了82 U/g,达到最高474 U/g。当(NH4）2SO4含量超过1%，营养成分呈下降趋势。(NH4）2SO4作为微生物生长的速效氮源，在发酵前期，对微生物的生长有利，但发酵培养基中(NH4）2SO4的含量过高，改变了培养基的碳氮比，导致微生物大量生长而不分泌或少分泌某些酶类，从而影响了各成分含量。

2.2 发酵条件对发酵产物营养成分的影响

2.2.1 温度对发酵产物营养成分的影响

将发酵培养基分别置于30、35、40、45℃恒温培养箱中培养5 d，结果见图4。

图4 发酵温度对发酵棉粕营养成分的影响

温度是微生物生长和产生代谢产物的重要影响因素之一，合适的发酵温度，有利于微生物的生长和代谢。从图4可知，在30～40℃范围内，粗蛋白含量，淀粉酶、脂肪酶活力随温度的升高而提高。当发酵温度为40℃时，达到最高，但随着发酵温度的进一步升高，各成分随之下降，可能是因为高温抑制了微生物产生酶所致。

2.2.2 pH值对发酵产物营养成分的影响

调节发酵培养基的pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，结果见图5。

图5 pH值对发酵棉粕营养成分的影响

从图5可以看出，发酵培养基的初始pH值为6.0时，粗蛋白含量为42.10%、淀粉酶活力1 037 U/g、脂肪酶活力548 U/g，较其他pH值条件下达到最高水平。当pH值为8.5时，发酵产物中的各营养成分最低。初始pH值大于6.0，发酵培养基中的各成分随之下降，其原因有待进一步研究。

2.2.3 含水量对发酵产物营养成分的影响

调整发酵培养基的含水量为30%、35%、40%、45%、50%、55%，40℃恒温发酵5 d，结果见图6。

从图6可以看出，随着发酵料中含水量的增加，粗蛋白含量也在增加，淀粉酶、脂肪酶酶活也随之提高，当含水量为50%时，粗蛋白含量达到40.99%，淀粉酶酶活887 U/g，比未发酵前540 U/g提高了347 U/g；脂肪酶活力比发酵前提高了233 U/g。但含水量超过50%，各成分下降明显。主要原因为发酵料中过高的含水量，可降低发酵料中氧气浓度，从而导致厌氧发酵，影响营养成分含量提高。

图6 含水量对发酵棉粕营养成分的影响

2.2.4 接种量对发酵产物营养成分的影响

按菌种接种量分别为（V/W）2%、3%、4%、5%、6%、7%接入发酵培养基中，结果见图7。

图7 接种量对发酵棉粕营养成分的影响

接种量的大小可直接影响发酵进度和代谢产物的生成量。接种量太小，延长发酵时间及增加杂菌污染的机会；接种量太大，可导致发酵前期营养物质消耗过快，不利于产物的形成和毒性物质的降解。图7结果表明，当接种量为6%时，发酵料中粗蛋白含量达到42.63%；淀粉酶活力1 158 U/g，比其他接种量条件下活力提高明显，与发酵前相比提高了618 U/g；脂肪酶活力比发酵前提高289 U/g，达到了538 U/g。但增加接种量，营养物质含量下降。

2.2.5 装量对发酵产物营养成分的影响

250 ml三角瓶中分别装入30、40、50、60、70、80、90 g固体发酵培养基，结果见图8。

图8 装量对发酵棉粕营养成分的影响

图8表明，当250 ml三角瓶中装入70 g发酵培养基时，粗蛋白含量、淀粉酶活力、脂肪酶活力与其他装量条件下相比，达到最高值，分别为42.94%、1 314 U/g、546 U/g。

2.2.6 发酵时间对发酵产物营养成分的影响

在得到的上述最优条件下，分别发酵3、4、5、6、7 d，结果见图9。

图9 发酵时间对发酵棉粕营养成分的影响

从图9可以看出，随着发酵时间的延长，发酵料中营养成分的含量和酶活也随之提高，到发酵第6 d，粗蛋白含量43.76%；淀粉酶活力1 306 U/g,提高了766 U/g；脂肪酶活力548 U/g，提高了299 U/g。发酵4 d，脂肪酶活力提高最低，比发酵前只提高了251 U/g。发酵3～5 d，淀粉酶活力、粗蛋白含量变化不明显。但随着发酵时间的延长，营养物质含量反而降低，主要原因是微生物代谢消耗所致。

2.3 正交试验结果分析

在单因素试验的基础上，选用（NH4）2SO4添加量、物料含水量、发酵温度和发酵时间作为考察的4个因素，分别选取3个水平，以粗蛋白含量、淀粉酶活力、脂肪酶活力为考察指标，结果见表1。

根据表1结果可知，处理4的粗蛋白含量显著高于其他8组处理及未发酵对照组(P＜0.05)，其他8组处理的粗蛋白含量也都极显著高于对照组(P＜0.05)。9组处理的淀粉酶活力均显著高于对照组(P＜0.05)，处理组1、2、3、5、6、7、8、9之间淀粉酶活力不存在显著性差异（P＞0.05），处理4最高为1 306 U/g，显著高于其他组处理（P＜0.05）。纤维素酶活力9组处理都显著高于对照组(P＜0.01)，处理1、2、3、7、8组间无显著差异（P＞0.05），处理5、6组间也不存在显著差异（P＞0.05），处理4活力较高，显著高于其他组（P＜0.05）。9组处理脂肪酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)，处理4脂肪酶活性最高达548 U/g，显著高于其他处理组（P＜0.05），处理组1、2、3和5之间不存在显著差异（P＞0.05），处理组6、7和8之间也不存在显著差异（P＞0.05）。由粗蛋白含量、淀粉酶活力和脂肪酶活力及极差分析可得出：A2B1C2D3为最佳设计方案，即（NH4）2SO4添加量1%，含水量50%，发酵温度40℃，发酵时间6 d。棉粕发酵后CP提高6.99个百分点、淀粉酶活力提高766 U/g、脂肪酶活力提高299 U/g，均显著高于未发酵对照组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 微生物固态发酵棉粕后蛋白质含量变化

五株芽孢杆菌和酵母菌发生协同作用，使得微生物大量繁殖，向细胞外分泌一定量的多肽、酶蛋白等物质，同时利用底物及非蛋白氮合成大量菌体蛋白[9]。由试验结果可知，发酵产物中，粗蛋白提高了6.99个百分点，比张庆华等报道提高的2.29%又提高了4.70个百分点，主要原因是微生物生长繁殖过程中消耗底物而导致发酵物的绝对含量减少和微生物利用非蛋白氮合成菌体蛋白，从而提高了发酵产物中粗蛋白含量[10]。

3.2 微生物固态发酵棉粕后酶活性变化

芽孢杆菌株在其生长繁殖过程中能够产生淀粉酶、纤维素酶和少量脂肪酶等酶类[11-12]。酵母菌能产生氨基酸、维生素(K、B、泛酸、烟酸、生物素、肌醇和叶酸等)[13-15]。微生物发酵产生的各种消化酶、氨基酸、维生素等也大大提高了棉粕的营养价值。在最佳发酵条件下，发酵产物中淀粉酶活力较发酵前的540 U/g提高了766 U/g，脂肪酶较发酵前的249 U/g提高了299 U/g。

3.3 微生物固态发酵棉粕的最佳条件

以粗蛋白含量、总游离氨基酸含量、淀粉酶活力、脂肪酶活力和纤维素酶活力作为固态发酵效果的评价指标，对复合芽孢杆菌和酵母菌共同固态发酵棉粕的组成及其配比，添加碳源、氮源种类及浓度，培养基的含水量进行了优化，得到固态发酵最佳条件为：棉粕∶麦麸为90∶10，（NH4）2SO4添加量1%，发酵温度40℃，物料含水量50%，接种量6%，装量为70 g/250 ml三角瓶，发酵时间6 d。

表1 L9（34）正交试验及结果

本试验按照得到的最优水平又进行了堆积发酵底物1 t验证，结果与预测结果接近，说明优化结果是可信的，具有较强的生产指导意义,为棉粕在畜牧水产养殖业中利用多菌种、多重发酵技术生产生物饲料提供了一条新途径。

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