LPSp对不同免疫方案中狂犬病毒抗原免疫效果影响的实验研究

申继清，王启辉，叶洁梅，王 健，冷 静*

(1广西医科大学基础医学院，南宁530021;2广西壮族自治区疾病预防控制中心; 3广西医科大学第一附属医院)

狂犬病是迄今为止人类致死率最高的可防不可治的急性传染病，预防与控制的惟一有效措施是接种狂犬病疫苗。目前使用的狂犬病疫苗大多为液体(含铝佐剂)和冻干(无佐剂)的纯化Vero细胞疫苗，其中铝佐剂可导致机体产生抗体迟缓、细胞免疫抑制，且液体疫苗稳定性差［1］;而冻干纯化Vero细胞疫苗虽然纯度高、稳定性好、毒副反应少、免疫后抗体阳转率较高，但需免疫5次、疫苗免疫原性低，且单独用疫苗接种后抗体产生较迟、维持时间短［2］。冷静等［3，4］、Leng等［5］及王健等［6］研究显示，成团泛菌脂多糖(LPSp)对乙肝表面抗原及纯狂犬病毒蛋白疫苗均有明显佐剂效应，且安全、活性高，但对含铝佐剂狂犬病疫苗佐剂效应不明显。2009年7月，我们观察了LPSp对小鼠不同免疫方案中狂犬病毒抗原免疫效果的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雌性Balb/c小鼠128只，6～8周龄，体质量18～23 g(广西医科大学实验动物中心);LPSp，质量浓度为2 mg/ml;狂犬病疫苗(含氢氧化铝)，本教研室自制，抗原含量为2.5 IU/ml;狂犬病毒蛋白，抗原含量为2.5 IU/ml;羊抗小鼠IgG单克隆抗体，AP标记;羊抗小鼠IgM单克隆抗体，AP标记;抗狂犬病毒标准阳性血清。

1.2 动物分组及处理 将120只Balb/c小鼠随机分为空白组、LPSp对照组、铝佐剂疫苗组、狂犬病毒蛋白组、LPSp实验组各24只，其中后四组分别背部注射LPSp、铝佐剂疫苗、狂犬病毒蛋白及狂犬病毒蛋白+LPSp进行1(第0天)、2(第0、15天)、4次(第0、7、15、21天)免疫(各8只)，狂犬病毒蛋白用量均为每只0.5 IU、LPSp用量为每只10 μg，用时以生理盐水配制为0.2 ml;空白组注射等量生理盐水。另取8只小鼠为常规组，按铝佐剂疫苗组免疫4次，并于第28天行第5次免疫。

1.3 血清抗狂犬病毒抗体检测 各组分别在初次免疫后第7、14、21、30、45、60天经眼内眦静脉取血，分离血清，采用间接ELISA法检测血清抗狂犬病毒抗体。以未免疫小鼠血清作为阴性对照，以10 μg/ml纯狂犬病毒蛋白包被96孔酶标板，4℃过夜，洗涤后用0.2%Gelatin于37℃温箱封闭2 h，洗涤后加入倍比稀释的待检血清，每孔50 μl，设阳性对照、阴性对照和空白对照，37℃温育1 h;洗涤后加AP标记的羊抗小鼠1 g，每孔50 μl(空白对照不加)，37℃温育1 h，充分洗涤后每孔加100 μl p-NPP底物反应液，37℃避光显色30 min，每孔加2 N NaOH溶液50 μl终止反应，在酶标仪上读取每孔OD405值。抗体最高稀释度计算以检测值/阴性对照值(P/N)≥2.1判定，实验测定值取组内小鼠测定值的几何平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理。计量数据经变量转换(取对数)后以¯x ±s表示，两两比较采用方差分析，检验水准α= 0.05。

2 结果

2.1 抗狂犬病毒IgG抗体滴度 空白组和LPS对照组不同时间抗狂犬病毒IgG抗体滴度均＜2;其余四组不同时间抗狂犬病毒IgG抗体滴度见表1。

2.2 抗狂犬病毒IgM抗体滴度 LPSp实验组在一次免疫后第7天IgM抗体滴度显著高于狂犬病毒蛋白组与铝佐剂疫苗组(P均＜0.05)，第7天后IgM抗体滴度下降，但2、4次免疫时又出现以上趋势。

表1 四组不同时间抗狂犬病毒IgG抗体滴度(n=8，±s)

表1 四组不同时间抗狂犬病毒IgG抗体滴度(n=8，±s)

注:与同免疫次数、同时间狂犬病毒蛋白组及铝佐剂疫苗组比较，*P＜0.05;与本组同时间免疫1次者比较，#P＜0.05，与免疫2次者比较，ΔP＜0.05;与同时间LPSp实验组、狂犬病毒蛋白组免疫4次者比较，▽P＜0.05;与同时间狂犬病毒蛋白组免疫2次者比较，▲P＜0.05

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3 讨论

研究显示，随狂犬病毒血清型变异及养犬热日益升温［7，8］，狂犬病发病率呈上升趋势。由于疫苗接种的依从性是影响免疫接种成功与否的关键因素之一，开发高效、安全、廉价、免疫程序短的新型狂犬病疫苗及新型疫苗佐剂已成为日前狂犬病疫苗研究领域中的重要内容。LPSp对细胞免疫及体液免疫均有辅佐作用，可增强多糖抗原及蛋白抗原的免疫反应;其在体内不易降解，对肿瘤、溃疡、烧伤、疱疹等多种疾病有肯定疗效。

本研究显示，免疫2、4次后LPSp实验组抗狂犬病毒IgG抗体滴度均显著高于狂犬病毒蛋白组和铝佐剂疫苗组，且4次免疫后抗体滴度在第60天仍呈上升趋势(抗体至少维持在8周以上)，而铝佐剂疫苗组IgG抗体滴度在45 d已达高峰，其后逐渐下降;各组免疫1、2次者免疫效果均欠佳。提示4次免疫后LPSp能持续刺激高滴度抗狂犬病毒IgG抗体产生，且使抗体维持更长时间;狂犬病蛋白疫苗免疫原性较弱。本研究还显示，LPSp实验组免疫4次者各个时间点IgG抗体滴度均显著高于常规组，且可维持更长时间;LPSp实验组免疫2次者IgG抗体滴度与铝佐剂疫苗组免疫4次者效果相当。提示LPSp佐剂疫苗的免疫效果优于铝佐剂疫苗，有望减少免疫次数、提高疫苗接种依从性。

此外，本研究还显示，LPSp实验组在第1次免疫后第7天IgM抗体滴度显著高于狂犬病毒蛋白组与铝佐剂疫苗组，第7天后IgM抗体滴度下降，但再次免疫时又出现以上趋势;免疫2次后LPSp实验组IgG抗体滴度达高峰时间显著早于狂犬病毒蛋白组和铝佐剂疫苗组。提示LPSp能显著增强IgM抗体产生;LPSp可能促进狂犬病疫苗免疫后的早期保护效果。

综上所述，LPSp作为狂犬病毒蛋白疫苗的佐剂可显著提高小鼠产生抗狂犬病毒IgG、IgM抗体的滴度，且可延长抗体的维持时间、减少接种次数，其效果优于铝佐剂。

［1］林海祥，Perrin P.铝佐剂对实验狂犬病疫苗的影响［J］.中华实验和临床病毒学杂志，1999，13(2):133-135.

［2］余光开，彭建一.狂犬病免疫程序研究［J］.中国人兽共患病杂志，1995，11(4):50-51.

［3］冷静，叶峻，黎肇炎，等.成团泛菌低分子脂多糖的分离纯化和鉴定［J］.广西医科大学学报，2003，20(6):840-842.

［4］冷静，韦锦斌.成团泛菌低分子脂多糖的遗传毒性研究［J］.广西医科大学学报，2007，24(5):676-677.

［5］Leng J，Wang QH，Wang J，et al.The regulatory effect of LPSp on hepatitis B surface antibody［J］.Chin J Chro Dis，2004，3(4):84-88.

［6］王健，冷静，王启辉.LPSp辅佐HBsAg诱导机体产生特异性抗体的机制［J］.细胞与分子免疫学杂志，2007，23(6):559-561.

［7］李浩，陶晓燕，宋淼，等.狂犬病高发地区犬只感染情况调查分析［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2008，22(3):161-164.

［8］梁炯明，卢耀娟，胡昱，等.玉林市10年狂犬病流行病学分析［J］.中国公共卫生管理，2009，25(2):177-178.