ROS在肾性高血压大鼠左室肥厚中的表达及意义

束长城 魏万林 高进

ROS在肾性高血压大鼠左室肥厚中的表达及意义

束长城 魏万林 高进

目的 研究活性氧(ROS)的表达与肾血管性高血压(RVH)大鼠左室肥厚的关系,探讨ROS在RVH大鼠左室肥厚发生、发展中的作用。方法 将20只体重200g左右的雄性Wistar大鼠,随机分为2组(n=10),建立两肾一夹肾血管性高血压大鼠左心室肥厚模型:对照组(SHAM)、实验组(2K1C),术后12周终止实验。结果 实验组收缩压(SBP)、左心室重量指数(LVMI)、心脏重量指数、心肌胶原容积分数(CVF)及活性氧(ROS)水平均显著高于对照组(P＜0.01),而抗氧化酶(SOD和GSHPX)的活性低于对照组(P＜0.01)。结论 肾血管性高血压大鼠ROS表达增多,提示ROS参与了肾血管性高血压左心室肥厚的形成过程。

高血压;肾血管性;左室肥厚;活性氧

左心室肥厚(left ventricu lar hypertrophy,LVH)LVH是导致心肌梗死、心力衰竭、心律失常、猝死等心血管事件的独立危险因素。探讨心肌肥厚的发病机理以及寻求有效的防治措施是当前研究的热点课题。近年来,左心室肥厚的病理生理研究取得重大进展,血压升高是常见的LVH重要因素外[1],氧化应激产物活性氧(ROS)与心肌肥厚的关系越来越受到国内外学者的关注[2-4]。高血压病引起ROS介导的心肌肥厚分子机制尚未明了。本实验拟在探讨 ROS与高血压心肌肥厚的关系,阐明高血压致心肌肥厚的分子机制,为临床防治心肌肥厚患者提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级Wistar雄性大鼠20只,每只体重 180～220 g,购自中国医学科学院实验动物研究所,合格证号:SCXK(京)2005-0013。

1.2 主要试剂和仪器 超氧化物岐化酶(SOD)、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和活性氧(ROS)ELISA试剂盒(R＆D systems公司);光学显微镜和T00llabⅥ.Ⅱ图像采集系统(德国Leica公司);北航医学图像分析管理系统由解放军军事医学科学院提供;BP-6型无创血压测量系统(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 模型制作与分组 Wistar雄性大鼠适应性喂养5 d后,随机分为2组(各10只):对照组(SHAM)、实验组(2K-1C)。采用经典造模法[5]复制两肾一夹高血压左心室肥厚模型(two-kidney,one-clip renal hypertension model,2K 1C)。用3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔内注射麻醉,行腹正中切口,游离左肾动脉并用内径为 0.25mm银夹钳夹,使左肾动脉部分狭窄,右侧肾动脉不触及。SHAM组方法相同,但不安置银夹。术后 4周末测定尾动脉血压,凡尾动脉收缩压比术前增高2.67KPa(20mm Hg)并高于15.96KPa(120mm Hg)的大鼠,视为模型成功。

1.4 标本的采集 大鼠普通饲料喂养 12周后处死,处死前12 h禁食,麻醉后称重。经腹主动脉取血 5m l,放入抗凝管中混匀,3500 r/m in离心10min,取上清夜-70℃保存。开胸迅速摘下心脏,预冷的PBS(0.02mmol/l,PH 7.4)灌洗,滤纸吸干,称重,并在 4℃下去除心房、右室游离壁、大血管和心包组织迅速分离左心室称重(包括室间隔),计算左心室重量指数 =左心室湿重/体重(g/kg)。在左室中部沿横轴切取0.5 cm厚的心肌组织置于10%的(甲醛)中固定,石蜡切片,VG染色测定心肌胶原容积积分(CVF)。左心室剩余部分快速放入液氮中冷冻,然后分别作抗氧化酶指标(SOD、GSH-PX)以及活性氧(ROS)的测定。

1.5 指标检测

1.5.1 鼠尾收缩压测定 测定方法采用tail-cuff测压法[6],血压计采用BP-6型无创血压测量系统。手术前、手术 4周及12周处死前各测压 3次取其均值。

1.5.2 心肌胶原组织学测定(Van Gieson法) 石蜡切片常规脱蜡至水,1%的酸性品红和 5%的饱和苦味酸染色。在VG(Van Gieson)法染色下,心肌细胞呈黄色,胶原呈红色。采用北航医学图像分析管理系统,测量心肌组织胶原容积积分(CVF=胶原面积/总面积)。在光镜下随机选取5个视野,以视野中所有胶原面积之和(不包括血管周围胶原面积)除以心肌纤维和结缔组织面积总和,得出CVF。

1.5.3 心肌组织中抗氧化酶(SOD、GSH-PX)和活性氧(ROS)的测定 匀浆的制备:随机切取左心室组织(0.2～0.5 g)称重后加入蒸馏水,在水浴中用匀浆器制备 1:10的匀浆。采用酶联免疫法(ELISA)测定SOD、GSH-PX及ROS的含量,试剂盒由R＆D systems公司提供,严格按照试剂盒说明书的要求进行操作。

2 结果

参加实验大鼠 20只,进入结果分析的大鼠为 19只(1只实验中死亡),实验对照组(SHAM)10只、实验组(2K 1C) 9只。

2.1 血压变化 由表1可见,手术前两组大鼠收缩压差异无显著性(P＞0.05),术后2K 1C组大鼠收缩压明显高于SHAM组,差异有显著性(P＜0.01)。

表1 两组动物收缩压变化比较（±s,mm Hg)

表1 两组动物收缩压变化比较（±s,mm Hg)

注:与SHAM组相比(1)P＜0.01

组别 例数 0周 4周 12周SHAM 10 105.65±4.32 109.27±5.21 119.57±6.30 2K 1C 9 105.02±3.97 151.12±9.28 174.34±14.52(1)

2.2 各组大鼠左室质量指数和左室心肌胶原容积积分(CVF)的变化 左室质量指数(LVMI)即左心室重量/体重(LVW/BW)和左室心肌胶原容积积分(CVF)是衡量左心室肥厚程度的重要形态学指标。由表2可见,肾动脉缩窄产生的压力超负荷导致的左室心肌肥厚,术后 12周 2K 1C组的左室质量指数(LVMI)及心肌胶原容积积分(CVF)较SHAM组显著性增加(P＜0.05)。VG染色结果显示见图1。

表2 两组大鼠左室质量指数及心肌胶原容积积分的变化

图1 2组大鼠心肌胶原表达的变化(×400)

2.4 两组大鼠左室心肌抗氧化酶和活性氧自由基的影响

由表3可见,2K 1C组与SHAM组相比,其抗氧化酶(SOD和GSH-PX)活力水平明显降低(P＜0.01)、ROS含量明显提高(P＜0.01)。

表3 两组大鼠左室心肌抗氧化酶SOD、GSH-PX以及ROS活性的变化（±s)

表3 两组大鼠左室心肌抗氧化酶SOD、GSH-PX以及ROS活性的变化（±s)

注:与2K1C组相比(1)P＜0.01

组别 例数 SOD GSH-PX ROS SHAM 10 105.12±7.20 86.51±4.24 10.20±1.38 2K 1C 9 97.58±6.26(1)80.58±6.95(1) 12.31±2.31(1)

3 讨论

心肌肥厚是高血压最常见的并发症,是心血管疾病的独立危险因素。现在研究普遍认为,左室肥厚的发生发展与压力或容量负荷过度、神经内分泌、细胞因子及细胞信号转导机制激活等因素相关[7]。

活性氧 ROS属于活性高的自由基,是生物体内产生的超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(-OH)、一氧化氮(ON)等活性含氧化合物的总称。自由基是机体内有机物分子的共价键通过均裂方式产生的,是具有不配对电子的原子团、分子或离子。自由基极不稳定,具有高度化学性,通过脂质过氧化作用,攻击蛋白质、核酸等方式对机体造成严重损伤,能破裂DNA,改变酶活性,破坏细胞膜结构,影响膜功能,参与疾病的启动和促进阶段[8]。Byrne研究发现[9]ROS可作为细胞内重要的第二信使,在心肌肥大发生过程中发挥着重要的生理功能。当机械压力、AngⅡ、脂类代谢异常以及内皮素等生理条件改变时,均可激活 NADPH氧化酶产生大量ROS,导致氧化应激发生,进而激活心肌肥大的发生发展[10]。

本实验采用的二肾一夹动物模型(2K1C)是经典的肾性高血压左室肥厚模型。实验结果显示,造模 12周后,2K 1C组大鼠收缩压相对处于一个稳定期,心肌肥厚比较明显,与对照组(SHAM组)比较,血压、左心室重量指数LVMI及CVF明显提高(P＜0.01),表明高血压左室肥厚模型成功建立,与国内外的文献报道一致[11,12]。2K 1C组大鼠左室心肌中 SOD和GSH-PX活力较SHAM组明显降低、ROS水平显著上升(P＜0.01)。说明心肌组织的ROS水平与心肌肥厚有重要的相关性,当心脏出现缺血缺氧、容量负荷增加等改变正常生理状态的情况下,心肌细胞内的抗氧化酶活性下降,氧自由基大量产生,导致氧化应激反应。ROS作用于心肌细胞膜的不饱和脂肪酸,导致细胞膜流动性、通透性和液态性发生变化,离子转运功能障碍,细胞膜的结构和功能造成破坏。此外,ROS能够破坏细胞内的溶酶体膜,使心肌细胞自溶,且影响肌浆网和线粒体,造成心脏能量代谢障碍,引起心肌凋亡、心脏重塑等,最终导致心肌肥厚。

肾性高血压大鼠左室肥厚的形成可能与激活体内氧化应激,产生大量 ROS密切相关。但心肌肥厚是十分复杂的过程,还受诸多因素影响,其确切作用机制还有待进一步研究。

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The relation between ROS and left ventricular hypertrophy in the ratswith renovascular hypertension

SHU Chang-cheng,WEIWan-lin,GAO Jin.Departmentof Cardiology,General Hospitalof Beijing Military Command,Beijing,100700,China

Objective To study the relation between ROS and left ventricular hypertrophy in the rats with renovascular hypertension.Methods Twenty male wistar rats,weighing about 200g each,were random ly divided into two groups(n=10):negative control group(SHAM),operation group(2K1C),at the 12th week to stop experiment.Systolic blood pressure(SBP)wasmeasured,collagen volume fraction(CVF)was detected by Van Gieson,and SOD、GSH-PX、ROSwere detected by ELISA.Results The results showed that the SBP、LVMI、CVF and ROS in 2K1C group significantly increased(P＜0.01).compared with the SHAM group,but the activitiesof GSH-Px and SOD were decreased(P＜0.01).Conclusion Increased expression of ROS in left ventricularmyocardium of rets with renovascular hypertension indicate thatROSmay play important roles in the development of ventricular hypertrophy of RVH rats.

Hypertension;Renovascular;Left ventricular hypertrophy;Reactive Oxygen Species

100700北京军区总医院心内科(束长城 魏万林);总参第 51研究所门诊部(束长城);武警总医院南楼二科(高进)

魏万林 Emal:wei_wanlin@126.com