重组人生长激素对体外人中性粒细胞功能影响

吴新海 郗文斌 屠伟峰

重组人生长激素对体外人中性粒细胞功能影响

吴新海 郗文斌 屠伟峰

目的 观察重组人生长激素(rhGH)对有无脂多糖(LPS)刺激的离体培养中性粒细胞(PMNs)呼吸爆发和粘附功能的影响。方法 分离纯化人外周静脉血PMN,加或不加LPS与三个不同剂量(10 ng/ml,100 ng/m l和1000 ng/ml)的rhGH共同孵育3 h,检测不同试验组的PMN呼吸爆发和粘附功能。结果 低浓度的rhGH(10 ng/ml)不影响PMNs的呼吸爆发功能和粘附功能,高浓度的的rhGH (100 ng/m l,1000 ng/ml)增强PMN的呼吸爆发和粘附功能,rhGH不影响LPS刺激的PMN的呼吸爆发功能,能增强LPS刺激的PMN的粘附功能。结论 一定浓度的rhGH能活化PMNs的呼吸爆发和粘附功能,增加LPS活化的PMNs与内皮细胞的粘附,加重炎症反应时PMNs对组织的损伤作用。

重组人生长激素;中性粒细胞;呼吸爆发;粘附

重组人生长激素(rhGH)由于具有促进蛋白合成、加速创面愈合等特点,已被临床用于烧伤、脓毒症、大手术术后等重症患者的辅助治疗。近来研究发现,rhGH不仅调节机体的代谢,还对免疫系统和免疫细胞的功能有调节作用[1]。本研究将探讨rhGH对离体培养的中性粒细胞(PMNs)呼吸爆发、与内皮细胞粘附的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 percoll分离液(Amersham Biosciences公司),胎牛血清(杭州四季青),RPMI-1640(Gibcol),国产rhGH (长春金赛药业有限公司),内皮细胞株(ECV-304)由南方医科大学试验中心馈赠;PMA和LPS购自sigma公司,NBT(上海华舜生物公司)。NAPCO 5410型CO2孵箱,biocell ht2酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 外周血PMNs的分离 取健康人外周静脉血15ml肝素抗凝(10 u/ml),采用percoll不连续密度梯度离心法分离PMNs[2]:取72%的percoll液15ml加于离心管底部,再轻轻将同体积63%的percoll液加在上面;然后将抗凝全血缓慢加在percoll之上;4℃,1800 rpm,离心25min。从分离液中取出PMNs,离心,去上清,用低渗溶涨法破除少量的红细胞,RPMI-1640冲洗一次;用RPMI1640培养基(含 10%的胎牛血清, 100 u/ml的青霉素和100u/m l的链霉素)制成PMNs悬液,调整其浓度为 2×106/m l。经台盼蓝排斥法证实其活力＞98%, W right-Giemsa染色鉴定其纯度＞95%。

1.2.2 分组 根据有无LPS刺激及不同浓度的rhGH分6组对照组(C组);LPS(100 ng/ml)组(L组);10 ng/ml rhGH组(R 1组),100 ng/m l rhGH组(R 2组),1000 ng/ml rhGH组(R 3组)和100 ng/ml LPS+100 ng/m l rhGH组(LR组)将分组后的PMNs置37℃,5%CO2的孵育箱中培养3 h检测呼吸爆发和粘附。

1.2.3 ECV-304细胞株的培养 用RPMI1640培养基将ECV-304细胞株制成 1×108/l的细胞悬液,加入 24孔培养板中,置37℃,5%CO2的孵育箱中培养,倒置显微镜观察至细胞呈铺路石状镶嵌排列的单层备用。

1.2.4 PMNs呼吸爆发的检测 参照Piva E,De Toni S等[3]的方法通过检测NADPH氧化酶的活性代表PMNs的呼吸爆发功能:在96孔板上,每孔加入50μl(2×106ml)的PMNs悬液、50μl的PBS和50μl的PMA(1.625μmol/l),室温震荡孵育10min,加入NBT(24μmol/l)后,立即用酶标仪在波长490 nm的条件下测一次吸光度(A),每隔5min测一次吸光度,一直测到 30 min,每份样本重复5次,取其平均值(A)。根据NBT的减少率来评价PMNs呼吸爆能力(NADPH氧化酶活性),计算公式为:

1.2.5 PMNs与内皮细胞粘附率的测定 将长成单层的ECV-304的培养基去掉,从各组培养的PMNs悬液中取0.5 m l加到ECV-304之上,放入培养箱中孵育30min,取上清液置不同试管中,并用等量的PBS液冲洗2次,冲洗液分别放置相应的试管中;上清液和冲洗液混均,计数脱落的PMNs。用以下公式计算PMNs与内皮细胞的粘附率:

1.3 统计学处理 所有数据用表示,用SPSS12.0软件进行组间 t检验,P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rhGH对有无LPS刺激的PMNs呼吸爆发功能的影响

与对照组相比,10 ng/ml的rhGH与PMNs共同孵育3 h不增强PMNs呼吸爆发能力;而100 ng/m l和1000 ng/m l的rhGH与PMNs共同孵育能增强PMNs的呼吸爆发能力,但两者之间差异没有统计学意义。加入LPS刺激时,PMNs的呼吸爆发功能增强;100 ng/ml的rhGH不影响LPS刺激的PMNs呼吸爆发功能。(见表1)。

表1 各实验组对PMNs呼吸爆发和粘附的影响

2.2 rhGH对有无LPS刺激的PMNs与内皮细胞粘附的影响

与对照组相比,10 ng/ml的rhGh不影响PMNs与内皮细胞的粘附率,100 ng/ml的rhGH和1000 ng/m l的rhGH能增强PMNs与内皮细胞的粘附(见表1);加入LPS刺激时,PMNs的与内皮细胞的粘附能力增强,rhGH能增加LPS刺激的PMNs与内皮细胞的粘附率。

3 讨论

本试验探讨不同浓度的rhGH对离体培养的PMNs呼吸爆发功能及与内皮细胞粘附的影响,结果发现 rhGH能增强PMNs的呼吸爆发功能,增加与内皮细胞的粘附率,这一作用呈剂量依赖性,只有达到一定的浓度这一影响才有统计学意义,但是当继续增加rhGH的浓度时,这一作用并没有随之增加。

早期临床研究发现:生长激素(GH)依赖的身材矮小患者常伴随有慢性肉芽肿疾病,肢端肥大症的患者的PMNs呼吸爆发功能增强和趋化能力减弱[4],推测GH与PMNs的功能存在某种联系,本实验结果证实了这种假设。正常成人血浆的GH的浓度在3～5ng/ml,而肢端肥大症患者可高达100～1000 ng/ml,所以实验为了探讨这一影响与浓度的关系,我们设置了10ng/m l、100 ng/ml、1000 ng/ml三个浓度组,结果发现低浓度的10ng/m l的rhGH不影响PMNs的呼吸爆发和粘附功能,因此我们推测在生理状态下分泌的 GH可能不影响PMNs的功能,只有在某些病理状态下(如巨人症和肢端肥大症)或者用rhGH治疗时,血清中的GH的常达到一定的浓度(＞100 ng/ml),才会对PMNs的功能产生影响,但1000ng/ m l的rhGH的影响并不比100 ng/ml的rhGH的更显著;由于条件的限制,在本实验我们只设置了三个浓度组,要阐明 rh-GH对PMNs影响的的量效关系需进一步研究。

rhGH常用于治疗烧伤、脓毒症患者,而这些患者体内大多处于炎症反应状态,PMN的功能被激活;最近有研究认为ICU患者使用大剂量的rhGH治疗,住院时间延长,死亡率增加[5],可能与炎症反应加重有关;本实验为了观察rhGH对活化的PMNs功能的影响,我们加入LPS作为刺激剂,观察rh-GH对LPS刺激的PMNs的呼吸爆发和粘附功能的影响;LPS是内毒素的主要成分,LPS可通过活化PMNs的呼吸爆发和粘附等功能[6],增加机体的炎症反应而加重组织的损伤。在本实验中,我们进一步证实LPS能增强PMNs的呼吸爆发和粘附功能;而rhGH不影响LPS刺激的PMNs的呼吸爆发,但能增加LPS活化的PMNs与内皮细胞的粘附率,所以用于治疗重症患者可能会加重活化的PMNs的组织的损伤;Liu等[7,8]研究也发现,GH治疗增加脓毒症腹膜炎大鼠循环中PMN的CD11 b的表达及呼吸爆发能力并促进肺微血管的损伤;Hansen等研究认为[9],GH和IGF-1都不直接刺激内皮细胞表达VCAM-1的作用,但 GH能通过间接调制循环中的介质增加VCAM-1的表达,有利于PMN粘附游走到血管外,发挥组织损伤的作用。

综上所述,rhGH能增强PMNs的呼吸爆发和与内皮细胞的粘附;而且能增强LPS活化的PMNs与内皮细胞的粘附;所以临床应用rhGH治疗可增强机体的防御能力,但是当机体处于炎症反应状态时,可能会加重PMNs对组织的损伤。

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Effects of recombinant human grow th hormoneon function of polymorphonuclear neutrophils in vitro

WU Xin-hai,XIWen-bing,TU Wei-feng.Department of anesthesiology,Shenzhen Hospital,Peaking University, Shenzhen518036,China

Objective To investigate the effectsof recombinant human growth hormone(rhGH)on respiratory burstand adhesion of polymorphonuclear neutrophils(PMNs)stimulated orunstimulated by lipopolysaccharide(LPS).M ethods PMNswere isolated and purified from the peripheral venous.PMNs stimulated or unstimulated by LPSwere cultured with different concentration of rhGH(10 ng/m l,100 ng/m land 1000 ng/m l)for 3 h to detect respiratory burst and adhere of PMNs.Results The lower concentration of rhGH(100 ng/ml) doesn'taffect the respiratory burstand adhesion of PMNs.The high concentration of rhGH((100 ng/ml,1000 ng/ml)enhance the respiratory burstand adhesion of PMNs.rhGH doesn'taffect the respiratory burst of PMNs stimulated by LPS.rhGH enhance the adhesion of PMNs stimulated by LPS.Conclusion rhGH in some concentration can activate the repiratory burstand adhere of PMNs,and increase adhesion of PMNs stimulated by LPS to provoke organ injury.

Human grow th hormone;Polymorphonuclear neutrophils;Respiratory burst;Adhesion

518036北京大学深圳医院麻醉科(吴新海);广州军区广州总医院麻醉科(郗文斌 屠伟峰)