北京犬ITS-2 rDNA的PCR扩增、克隆及分析

张新高 王立欣 侯 杰

（1.广东省深圳市南山区动物防疫监督所，深圳 518051；

2.华南农业大学兽医学院，广州 510642）

北京犬ITS-2 rDNA的PCR扩增、克隆及分析

张新高1王立欣2侯 杰2

（1.广东省深圳市南山区动物防疫监督所，深圳 518051；

2.华南农业大学兽医学院，广州 510642）

本研究以从中国广东深圳某动物医院采集的北京犬血液样品为研究对象，经反复摸索，选用LA Taq 酶结合降落PCR方法，成功地扩增出北京犬的核糖体基因组（rDNA）的第2内转录间隔区（ITS-2）序列。将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体，用PCR技术及酶切鉴定阳性菌落，对阳性菌落质粒DNA进行测序。结果表明，ITS-2片段大小为1 138bp，GC含量为83.57%。本研究为犬线粒体等真核生物高GC含量序列的有效扩增作了有益的探索。

北京犬 ITS-2 高GC含量 PCR 克隆

人和犬（Canis familliaris）的密切联系已有很长的历史，犬的饲养至少已有14 000年历史，其祖先是灰狼（Canis lupus），犬在世界的普遍饲养，显示其一直以来在人们的生活中起到重要作用[1-2]。在几万年之前，波斯人和希腊人就开始饲养犬这种家畜。在中国西安半坡遗址和常州圩墩遗址中发现了犬的骨骼，推断我国养犬的历史也有约5 000～6 000年之久[3]。近年来，随着国内经济的迅速发展，人们生活水平得到提高，宠物犬饲养量不断增多。对于现代犬种的种群关系以及形态多样的品种之间的亲缘关系，众多研究者一直有很大的兴趣，对于犬品种的多样化的起源以及品种的关系在考古学以及生物学等多方面进行探讨，但仍然存在很多争议。

随着科技的不断进步，分子遗传学分析为犬的遗传变异及种群遗传学研究等提供了新的手段，从基因水平上反映犬种的遗传信息可以明确犬种的遗传变异水平以及种群分析。研究表明，rDNA的ITS-2序列在生物化过程中显示种的特征，种内具有高度保守性，在不同种间又有不同程度的变异，是理想的种间鉴定的遗传标记[4-7]。本试验以从中国广东深圳某动物医院采集的北京犬为研究对象，对其核糖体DNA内转录间隔区ITS序列进行PCR扩增、测序，为犬品种的分子鉴定和分子遗传学研究提供了科学根据，也为扩增高GC含量序列的同类研究提供借鉴、例证。

1 材料和方法

1.1 犬血样

犬血样采自中国广东深圳某动物医院，犬的品种为北京犬，样品编号为L4，2 ml全血加0.3 ml 0.5%的EDTA，血样置于-20℃保存。

图1 北京犬核糖体ITS-2序列PCR产物电泳图

1.2 主要试剂

LA Taq酶，GC buffer Ⅱ，DL-2000 DNA Marker均为TaKaRa产品；pGEM-T Easy载体试剂盒、感受态细胞JM109为Promega产品；DNA胶回收试剂盒为上海生工产品。

1.3 DNA提取

取-20 ℃冷冻保存的外周抗凝血，用2 ml离心管装500 μl血样，置于冷冻离心机内，在4℃，3 000转/分的条件下离心20 min，去除血浆，以酚-氯仿法提取总DNA。

1.4 PCR扩增

本试验中扩增（L4）犬线粒体ITS-2序列的引物为：C5.8SF：5’- CGA AAG CAC TTG TGG CCC TGG GTT CCT C-3’；CITSR：5’-CCG TTT ACC TCT TAA TGG TTT CAC GCC CTC-3’，由上海英峻生物技术有限公司合成。PCR扩增体系为25μl，各组分如下：2×GC buffer Ⅱ 12.5 μl，2.5 mM each dNTPs 4 μl，50 μM 的上下游引物各0.25 μl，LA Taq酶0.25 μl，模板DNA 1 μl，灭菌双蒸水6.75 μl。PCR反应条件为：先94 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 sec，68 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5个循环，后94 ℃变性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。同时设不加DNA模板的阴性对照。扩增产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳，于紫外透射仪上观察并记录结果。

1.5 扩增片段的克隆及筛选

以DNA胶回收试剂盒对所扩增片段进行纯化，纯化产物连接到pGEM-T Easy载体上，将连接产物转化至感受态细胞JM109中，在含氨苄青霉素和IPTG的LB平板上无菌挑选白色的单菌落，对菌落进行PCR鉴定和酶切鉴定，筛选获得阳性克隆。

图2 北京犬ITS-2片段的菌液PCR鉴定图

图3 北京犬ITS-2片段重组质粒的酶切鉴定图

1.6 测序

将鉴定为阳性的重组菌送上海英峻生物技术有限公司进行双向测序，然后进行序列分析。

2 结果

2.1 ITS及5.8S序列的PCR扩增

以提取的北就犬的基因组为模板，以C5.8S和CITSR作为引物进行PCR扩增，同时设不加DNA模板的阴性对照。PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳，可见约1 500 bp的条带（图1），与预期目的片段大小一致。

2.2 ITS-2片段的克隆、PCR和酶切鉴定

用纯化回收试剂盒回收PCR产物并将之克隆到pGEM-T Easy载体中，转化至感受态细胞JM109，后进行PCR鉴定。结果，8个单菌落均为阳性（见图2），对PCR鉴定为阳性的3个单菌落进行质粒小量抽提，所得重组菌分别标为：pGEM-O1和pGEM-O2和pGEM-O3；经EcoRⅠ酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳出现两条带，小片段约为1 500 bp，为插入的片段，大片段为质粒载体（见图3）。

2.3 测序

测序结果表明，北京犬ITS-2片段大小为1138时间bp，GC含量高达83.57%，序列如下：

3 讨论

核糖体DNA（rDNA）是由一些高度重复序列组成的多基因家族。rDNA基因的高度保守性使其突变累积在成串重复排列的rDNA之间和两侧的间隔区序列中，而使核糖体基因间隔区序列具有种内和种间、以及亚种和株的特异性，从而用于分类学和种株鉴定。ITS是rDNA中介于18S和28S之间的内转录间隔区，包括ITS-1和ITS-2两段序列。研究表明，rDNA的ITS-1及ITS-2序列在生物进化过程中显示种的特征，种内具有高度保守性，在不同种间又有不同程度的变异，是理想的种间鉴定的遗传标记，应用于多种生物的分子鉴定和分子遗传学研究[8]虽然rDNA序列对进化关系的确定、个体差异的检测以及构建遗传图谱有重要价值，但由于真核生物基因组的rDNA具有较高的GC含量，而且是结构复杂的重复序列，采用通常的PCR扩增难以成功，特别是高GC含量的大片段尤其困难，因此在PCR的反应条件上，有人采用退火温度较高的一般PCR反应条件，也有采取用热启动PCR方法的，还有采用降落PCR（TDPCR）反应条件的，取得一定的效果[9-13]。标准的TD-PCR一般需设置多个退火温度，程序比较复杂，而且特异性产物量较少。本研究经反复摸索，选用LA Taq 酶结合降落PCR方法，成功地扩增出北京犬（L4）的核糖体基因组的ITS-2序列，将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体，用PCR技术及酶切鉴定阳性菌落，对阳性菌落质粒DNA进行测序。结果表明，ITS-2片段大小为1138bp，GC含量高达83.57%。本研究的降落PCR只设置2个退火温度，程序简单，特异性产物多，获得良好的反应效果，为犬种的遗传变异水平以及种群分析等进一步研究奠定了基础，也为高GC含量序列的有效扩增作了有益的探索。

图4 北京犬rDNA ITS-2 序列

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