鸦胆子油乳注射液对SKMG-4胶质瘤细胞的作用研究

杨利辉，石文建，赵喜庆，汪洪江

（华北煤炭医学院附属人民医院神经外科，河北 唐山 063000）

鸦胆子油乳注射液对SKMG-4胶质瘤细胞的作用研究

杨利辉，石文建，赵喜庆，汪洪江

（华北煤炭医学院附属人民医院神经外科，河北 唐山 063000）

目的 本实验拟研究鸦胆子油乳注射液对人脑胶质瘤细胞SKMG-4细胞生长抑制及诱导细胞凋亡的作用。方法 体外培养人脑胶质瘤细胞SKMG-4，利用MTT比色法检测鸦胆子油乳注射液对于SKMG-4的增殖抑制影响；用流式细胞术（flowcytometry，FCM）分析药物处理前后SKMG-4的细胞周期变化；实时荧光定量pcr检测不同处理组中凋亡基因bcl-2的表达。结果 MTT显示鸦胆子油乳注射液对SKMG-4细胞增殖抑制作用呈剂量依赖性，当浓度为5 g/L时，对SKMG-4细胞增殖的抑制率达到（72.1±2.2）%（P＜0.05）；流式细胞仪分析显示，用5 g/L鸦胆子油乳注射液培养48 h，细胞周期中G1期所占比例增高，S期占细胞周期的比例降低；实时荧光定量pcr结果显示随着鸦胆子油乳注射液的浓度增加凋亡基因bcl-2mRNA的表达逐渐减少。与对照组比较P＜0.01。结论中药鸦胆子油乳注射液可显著抑制SKMG-4胶质瘤细胞细胞增殖及促进其凋亡。

鸦胆子油乳注射液；人脑胶质瘤；Bcl-2；凋亡

鸦胆子是苦木科植物鸦胆子的成熟果实的提取物，研究发现其对癌细胞有较高亲和力，单独应用可以抗癌，具有扶正固本作用；联合放、化疗有增效减毒的作用；提高机体免疫力；保护骨髓造血功能，提升外周血象；毒性小、副作用小，临床应用安全。本实验通过体外实验验证了鸦胆子油乳注射液对胶质瘤细胞的抑制作用。

1 材料

1.1 细胞株

人脑胶质瘤细胞SKMG-4株有中山大学附属肿瘤医院神经外科惠赠。

1.2 药品及试剂

鸦胆子油乳注射液购自沈阳药科大学制药厂（每支10mL，含鸦胆子油乳1 g）DMEM（HighGlycose）液体培养基购自Hyclone公司，胎牛血清，MTT、碘化丙啶（PI）、二甲亚砜均购自Sigma公司，兔抗人Bcl-2、SABC法免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司。实时荧光定量PCR试剂盒购自天根公司。

2 方法

2.1 MTT比色法检测鸦胆子油乳注射液对细胞的增殖抑制

收集对数生长期细胞，用DMEM（含10%新生牛血清）细胞培养液调整细胞浓度为1×104/mL的细胞悬液，加入96孔圆底细胞培养孔内，每孔0.1 mL，置于37℃、饱和湿度、5%CO2条件下常规培养12 h后,实验组加入0.1 mL鸦胆子油乳注射液使药物终浓度分别为5 g/L、2.5 g/L、1.25 g/L、0.625 g/L，每组设5个复孔，对照组除未加鸦胆子油乳注射液外，其余条件完全一致。37℃饱和湿度、5%CO2条件下培养48 h后，加入pH7.4 PBS配制的5 g/L MTT 20μL/孔，再置37℃、5%CO2条件下4 h。取出，吸取上清液。加入DMSO 0.2 mL/孔，混匀30 min后在酶联检测仪上570 nm波长处测A570值，以A570间接反映存活细胞数量。据此可推测各浓度鸦胆子对胶质瘤细胞的抑制率，抑制率=（A对照组-A用药组）/A对照组×100%。

2.2 流式细胞仪分析细胞周期变化

分别收集不同药物浓度处理组和对照组处理48 h的SKMG-4细胞，均匀打散，PBS清洗1次，用预冷的70%乙醇重悬，且在4℃过夜。PBS清洗2次，分别加入PI（400 mg/mL）和RNaseA（1 mg/mL）各50 μL。4℃静止30 min，然后上流式细胞仪进行周期分析。

2.3 实时荧光定量pcr检测不同处理组中凋亡基因bcl-2的表达

将调整至同一浓度的各组总RNA分别逆转录合成cDNA，以β-actin为内对照进行实时荧光定量pcr，基因引物序列（表1）。首次循环先在95℃变性2 min，然后变性、退火、延伸分别为95℃ 20 s，58℃ 25 s，72℃ 30 s，共45个循环，最后72℃延伸5 min。根据CT值计算出对照组基因和处理组基因的ΔCT，再用对照组ΔCT-处理组ΔCT得到ΔΔCT，最终根据2-（ΔΔCT）得出处理组样本基因相对于对照组样本基因的量。

表1 基因引物序列

3 结果

3.1 鸦胆子油乳注射液对SKMG-4细胞增殖抑制作用

鸦胆子油乳注射液对SKMG-4细胞的增殖抑制作用呈现剂量依赖性。当浓度为5 g/L时对胶质瘤的抑制率为（72.1±2.2）%，与对照组相比P＜0.05。随着药物浓度的降低对胶质瘤的抑制率随之降低，当浓度为0.625 g/L时抑制率为（16.0±2.5）%，与对照组相比P＜0.05（表2）。

3.2 流式细胞仪对细胞周期的作用

随着鸦胆子油乳注射液浓度的增加，细胞周期中G1期的比例逐渐增加，S期的比例逐渐减小，说明鸦胆子油乳注射液对SKMG-4的抑制再G1期（表3）。

3.3 鸦胆子油乳注射液对SKMG-4细胞bcl-2基因表达的影响

表2 不同浓度的鸦胆子对SKMG-4细胞抑制情况（n=5，）

表2 不同浓度的鸦胆子对SKMG-4细胞抑制情况（n=5，）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别 浓度（g/L） A570 抑制率（%）对照组 0 0.65±0.02 0药物组 5 0.24±0.01* 72.1±2.2*2.5 0.33±0.02* 56.4±3.4*1.25 0.46±0.02* 33.6±3.6*0.625 0.56±0.01* 16.0±2.5*

表3 不同浓度的鸦胆子对SKMG-4细胞周期分布的影响（n=5，）

表3 不同浓度的鸦胆子对SKMG-4细胞周期分布的影响（n=5，）

注：与对照组相比，*P＜0.05；**P＞0.05。

组别 浓度（g/L） G1% S%对照组 0 57.8±0.3 29.4±0.3药物组 5 71.3±0.5 * 11.7±0.3*2.5 67.5±1.1 * 17.3±0.3*1.25 63.4±0.2 * 21.6±0.2*0.625 59.2±0.2 ** 25.1±0.2**

随着鸦胆子油乳注射液作用浓度的增加，SKMG-4细胞的bcl-2基因的mRNA表达明显减少，与对照组相比P＜0.01（表4）。

表4 不同药物浓度处理的SKMG-4细胞中bcl-2mRNA的表达（n=5，）

表4 不同药物浓度处理的SKMG-4细胞中bcl-2mRNA的表达（n=5，）

注：与对照组相比，*P＜0.01。

组别 浓度（g/L） 2-ΔΔCT对照组 0 1药物组 5 0.025±0.004*2.5 0.076±0.005*1.25 0.186±0.029*0.625 0.771±0.074*

4 讨论

鸦胆子为苦木科植物的成熟果实，鸦胆子油乳以鸦胆子石油醚提取物为原料，以精制大豆磷脂为乳化剂制成的水包油乳剂。研究表明，鸦胆子油乳可促进骨髓干细胞形成，与放疗和／或化疗联合用有一定的防止白细胞和血小板降低的作用[1]。临床上鸦胆子油乳已联合化、放疗已广泛应用于肺癌[2-3]、肝癌[4]、食管癌[5]、胰腺癌[6]等多种恶性肿瘤的治疗。但对胶质瘤的研究较少。

此实验通过MTT比色法、流式细胞法、实时荧光定量PCR观察鸦胆子油乳注射液对胶质瘤SKMG-4细胞生长的影响。MTT结果表明随着鸦胆子油乳注射液浓度的增加，对SKMG-4细胞增值抑制作用逐渐增强。当药物浓度为5 g/L时，对胶质瘤细胞有明显的抑制率为（72.1±2.2）%，与对照组比较P＜0.05，而浓度为0.625 g/L时药物对胶质瘤的抑制作用较弱为（16.0±2.5）%（P＜0.05）。说明鸦胆子油乳注射液对胶质瘤的抑制呈剂量依赖型。

正常细胞周期主要由G1、S、G2和M期组成。其中以G1～S期转换和G2～M期转换最为重要。而G2～M调定点被认为是肿瘤治疗敏感性的主要决定因素[7]。此实验研究表明，随着鸦胆子油乳注射液的浓度增加，G1期占细胞周期的比例逐渐增加，S期占细胞周期的比例逐渐减低。G1期的增加说明鸦胆子油乳注射液使胶质瘤细胞停止在G1期。S期即DNA合成期，可反应细胞的增殖情况。S期占细胞周期的比例高,则提示DNA合成活跃。一般而言，肿瘤细胞的S期比例较正常细胞要高，其增殖活性也较正常细胞高[8]。流式细胞分析显示随着药物浓度的增加G1期逐渐增加，S期逐渐降低，与对照组相比，P＜0.05。推测鸦胆子油乳注射液可能在S期抑制DNA的合成，从而使肿瘤细胞停滞在G1期。

近年来，凋亡（apoptosis）在肿瘤发生中的作用日益受到重视。bcl一2蛋白作为一种抑制凋亡因素调节肿瘤细胞凋亡，研究表明其异常增加可抑制其它促凋亡因素的作用[9]。Bcl-2基因处于凋亡调控的终末部分，通过抑制肿瘤细胞的凋亡，可使肿瘤细胞生存时间延长，在肿瘤的发生、发展中起重要的作用[10-13]。大量研究表明，Bcl-2表达情况与脑胶质瘤的分级和预后有相关性，并且Bcl-2表达还牵涉到肿瘤对放、化疗的敏感性。本实验通过实时荧光定量分析显示随着鸦胆子油乳注射液的增加bcl-2mRNA的表达逐渐减少，当浓度为10 mg/L时，bcl-2mRNA表达为0.025±0.004，与对照组比较P＜0.01，说明鸦胆子油乳注射液可通过抑制bcl-2表达来促进细胞的凋亡。

此实验明确了鸦胆子油乳注射液对胶质瘤细胞有明确的抑制生长作用，诱导细胞凋亡，阻滞细胞生长周期于G1期是其抗瘤的重要机制，抑制bcl-2基因的表达在一定程度上参与了这一过程。但此实验只是在体外环境下研究鸦胆子油乳注射液抑制胶质瘤细胞的生长情况。由于体内环境的特殊性，鸦胆子油乳注射液能否在体内发挥作用将是我们进一步研究的目标。

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Brucea javanica oil emulsion injection to dare crow SKMG-4 glial cells research

YANG Li-hui,SHI Wen-Jian,ZHAO Xi-qing,WANG Hong-jiang
(People Hospital Affi liated Noth China Coal Medical College Hebei Tangshan,Hebei 063000,China)

Objective To explore the effect of brucea javanica oil emulsion on apoptosis and restrain the grow of human glioma SKMG-4.Methods cultured human SKMG-4 glioma cells.Using MTT colorimetric assay to measure the inhibitory effect on proliferation of brucea javanica oil emulsion for SKMG-4 golima.Using flow cytometry analysis of drug treatmeat before and after the cycle of SKMG-4 glioma cells.Using real-time quantitative PCR to measure the express of bcl-2 in different group.Results The result of MTT showed the restrain of brucea javanica oil emulsion for SKMG-4 glioma are dose-dependent.When the consistence is 5g/l,the proliferation rate is(72.1±2.2)% (P＜0.05).Flowcytometry analysis showed that,with 10g/L brucea javanica oil emulsion cultured 48h,cell cycle G1 phase proportion increased,S phase cell cycle reduction in the proportion accounted for.Real-time quantitative PCR show with the increasing of brucea javanica oil emulsion the express of bcl-2mRNA becoming lower and lower.Compared with contrast group P＜0.01.Conclusion The brucea javanica oil emulsion can remarkably restrain the multiplication of SKMG-4 glioma and promote the cell to apoptosis.

Brucea Javanica Oil Emulsion;Golima;Bcl-2;Apoptosis

R739.41

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2011.04.008.022.03

2011－02－07

杨利辉（1984－），男，河北邢台人，在读硕士研究生，主要从事胶质瘤的化疗工作。

马宏宇）