灵芝孢子粉对PTZ致痫大鼠神经细胞野生型p53表达的影响①

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(1.右江民族医学院病理生理学教研室,广西 百色 533000 E-mail：zhsh8000@163.com;2.广西医科大学解剖学教研室,广西 南宁 530021;3.佳木斯大学基础医学院病理生理学教研室,黑龙江 佳木斯 154007)

癫痫(Epilepsy,EP)是一种神经元发作性异常放电引起的、以反复痫样发作为特征的临床症候群,为临床常见慢性脑部疾患。癫痫发作可导致通过细胞凋亡实现的神经细胞损伤,虽出现较晚,却能持续存在,进而可以参与海马硬化等过程[1]。而野生型p53基因(wtp53)是诱导细胞凋亡的基因之一,因此,探讨wtp53基因表达变化与癫痫发病的关系及其调控机制,成为了当前癫痫发病机制研究中的课题之一。

灵芝属珍贵的药用真菌,其生殖细胞——灵芝孢子(粉)(ganoderma lucidum spore powder)作为灵芝的重要药用部位逐渐为人们所认识,灵芝孢子粉是灵芝发育后期弹射释放出的种子,生物学上称担孢子,集中起来呈粉末状。灵芝孢子粉含有丰富的天然抗氧化成分、氨基酸和各种微量元素,具有免疫调节、清除自由基、提高机体携氧能力和耐受缺氧能力等作用,可提供大脑所需能量且对神经系统具有镇静和保护功能[2]。然而其对癫痫防治作用尤其是对神经细胞的保护作用研究鲜有报道。本研究旨在观察灵芝孢子粉对戊四氮(PTZ)点燃大鼠wtp53免疫反应性的影响,进一步探讨灵芝孢子粉对癫痫神经细胞凋亡抑制作用可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性成年SD大鼠60只,10周龄,体重(200±20)g,由广西医科大学实验动物中心提供(动物合格证编号：SCXK桂2009-0002),动物于实验前1周置于实验室适应环境,按照自然昼夜、普通环境饲养,室温(25±1)℃,自由饮食。实验动物随机分为空白对照组,癫痫模型组,灵芝孢子粉用药A、B、C即高、中、低剂量 3组(分别灌胃给予灵芝孢子粉150mg/kg、300mg/kg及450mg/kg),共分为5个小组,每组12只。

1.2 药品试剂及仪器 PTZ购自美国Sigma公司;灵芝孢子粉取自泰山灵芝孢子为棕色粉末状物质;wtp53多克隆抗体、sABC法免疫组化检测试剂盒、DAB试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 癫痫模型的复制 PTZ用前以生理盐水配制成溶液(10g/L),灵芝孢子粉用药各组和癫痫模型组用PTZ亚惊厥剂量(35mg/kg)腹腔注射,每日1次,持续28天,正常对照组以等容生理盐水代替PTZ腹腔注射。灵芝孢子粉组腹腔注射PTZ的同时再经灌胃给予灵芝孢子粉(A组：150mg/kg;B组：300mg/kg;C组：450mg/kg),灌胃前禁食 6h,灌胃体积为10.0ml/kg,每日 1次,持续28天;癫痫模型组和空白对照组同时经灌胃给予同体积生理盐水。大鼠癫痫发作评分标准按Ono法[3]：0级,无任何发作反应;Ⅰ级,节律性点头或面部抽动;Ⅱ级,阵挛性咀嚼或者点头甩尾;Ⅲ级,头部颤搐加前肢阵挛性抽搐;Ⅳ级,袋鼠姿势或多肢抽动;Ⅴ级,失去平衡,跌倒;Ⅵ级,全面持续强直-阵挛发作。每天对每只鼠在PTZ注射后观察30～60min,并记录癫痫发作的级别。停药1周,再用相同剂量的PTZ测试,诱发癫痫发作,凡出现连续5次Ⅱ级或Ⅱ级以上惊厥发作的大鼠为达到点燃标准的动物模型。

1.4 取材及wtp53免疫组织化学检测 乙醚麻醉断头处死大鼠,取脑,立即分离出海马区组织,吸去血迹,置于4%多聚甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,6μ m切片备检。石蜡切片经常规脱蜡水化后,用过氧化物酶阻断剂阻断内源性过氧化物酶活性,PBS冲洗后,用成套sABC免疫组织化学试剂盒检测wtp53表达水平。一抗分别为兔抗大鼠wtp53抗体,以PBS代替一抗作阴性对照,孵育切片。具体操作步骤按sABC免疫组织化学试剂盒说明书进行。DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。于光镜下观察wtp53阳性细胞的表达情况,应用彩色病理图文分析系统进行图像分析,每张切片海马CA1区随机选取6个具有代表性的非重叠高倍视野,在显微镜下(×400)微尺计数海马CA1区线性1mm长度的wtp53阳性细胞,并计算平均阳性细胞数。

2 结果

2.1 行为学观察 癫痫模型组及灵芝孢子粉用药各组大鼠在注射亚惊厥剂量PTZ后第6天开始出现发作反应,均有连续多次Ⅲ～Ⅵ级的癫痫发作,每次发作持续1～20min不等。上述各组实验动物均达到点燃标准,癫痫模型复制成功。空白对照组大鼠则无异常行为改变。

2.2 各组大鼠海马CA1区神经细胞wtp53蛋白表达结果 40×10倍光镜下,细胞核有浓染的深棕褐色为wtp53免疫阳性细胞。癫痫模型组与空白对照组比较,wtp53免疫阳性细胞数明显增多(P＜0.01),免疫反应增强;灵芝孢子粉高剂量用药C组与癫痫模型组比较,wtp53免疫反应性减弱,阳性细胞数明显减少,仅呈散在分布,差异有显著性(P＜0.05);以PBS代替一抗的对照反应均为阴性。结果见表1。

表1 各组海马CA1区wtp53蛋白表达水平 (±s)

表1 各组海马CA1区wtp53蛋白表达水平 (±s)

与对照组比较,a：t=22.76,P＜0.01;与模型组比较,b：t=1.55,c：t=1.87,P 均＞0.05;d：t=5.13,P＜0.05

组别 用药剂量(mg/kg) n wtp53阳性细胞数对照组 同体积生理盐水 12 3.26±2.39模型组 同体积生理盐水 12 55.72±7.62a用药A组 150 12 51.29±6.31b用药B组 300 12 47.33±13.52c用药C组 450 12 38.74±8.56d

3 讨论

p53基因分为野生型和突变型两种,突变型p53(mtp53)基因是一种癌基因,可以促进癌瘤的发生发展;野生型p53基因存在于细胞内,为一种抑癌基因,一方面具有转录因子功能,对细胞的生长分化进行调控,同时也作为某些抑制细胞增殖基因的反式激活因子对细胞分裂进行负调控,另一方面它监视着细胞基因的完整性,抑制细胞周期推进以及诱导细胞凋亡。有研究显示[4],wtp53基因诱导细胞凋亡的可能机制为：降低细胞内源性Bcl-2蛋白表达并抑制其功能,Bcl-2基因作为重要的凋亡调控基因,可通过抑制线粒体膜tbid插入、Bax转位和Bax/Bax寡聚化起到抑制细胞凋亡的作用;wtp53基因还可连接于Bax启动子上,提高细胞中Bax的表达,使Bcl-2/Bax比例失调,从而促进细胞凋亡,因此,Bax可作为wtp53立刻早期反应基因。

另有研究表明[5],PTZ致痫后大鼠海马CA1区wtp53蛋白大量表达出现的最早时间和高峰时间与原位末端标记(TUNEL)法检测到的神经细胞凋亡反应时序相吻合,阳性反应区域相同。大量凋亡的锥体细胞内wtp53蛋白阳性表达明显增多[6],本实验结果也进一步证实了wtp53基因参与了癫痫发作后海马区神经细胞凋亡的过程。癫痫发作可使脑细胞内外环境发生剧烈变化,从而导致脑组织损伤。癫痫发作后神经细胞发生凋亡,wtp53基因在此过程中可起到重要的调控作用。

灵芝是一种珍贵的药用真菌,富含灵芝多糖、多肽、有机锗等成分,对神经系统具有调节功能,可使肌肉松弛,减少动物自发活动,对抗电惊厥,有镇静、镇痛、降低副交感神经的兴奋性等作用[7]。本实验经灌胃给与大鼠灵芝孢子粉后,高剂量用药组大鼠较癫痫模型组海马区wtp53蛋白表达明显减少(P＜0.05),说明灵芝孢子粉对诱导痫性发作后的神经细胞凋亡具有抑制作用,其抑制凋亡的分子机制可能是通过下调wtp53蛋白表达实现的,这为灵芝孢子粉作为一种治疗癫痫的辅助用药,改善脑部功能,对脑组织具有一定保护作用提供了新的依据。

[1]Zhao S,Wang SQ,Zhang SC,et al.Effect of ganoderma lucidum spores powder on the expression of IGF-1、NF-κ B and the apoptosis of nerve cells in the epileptic rat brain[J].Neural Regeneration Research,2008,3(8)：858-862.

[2]Shapleske J,Rossell SL,Woodruff PW,et al.The planum temporale：a systematic,quantitative review of its structural,functional and clinical significance[J].Brain Res Brain Res Rev,1999,29(1)：26-49.

[3]Yue W,Liu YX,Zang DL,et al.Inhibitory effects of succinic acid on chemical kindling and amygdala electrical kindling in rats[J].Acta Pharmacol Sin,2002,23(9)：847-850.

[4]Yi X,Yin XM,Dong Z.Inhition of bid-induced apoptosis by Bcl-2：tbid insertion,Bax translocation and Bax/Bax oligomerization suppressed[J].J Biol Chem,2003,278(19)：16992-16999.

[5]程桂玲,吕涌涛,迟兆富,等.戊四氮致痫大鼠脑p53蛋白表达与神经细胞凋亡关系的研究[J].中风与神经疾病杂志,2002,19(5)：291-293.

[6]陈利锋,柯以铨,王松青,等.小剂量3-NPA对KA致痫大鼠海马神经细胞凋亡和p53蛋白表达的影响[J].中华神经医学杂志,2005,4(10)：987-990.

[7]周子懿,唐宇平,金惠铭,等.灵芝防治神经系统疾病的实验研究进展[J].上海中医药杂志,2008,42(7)：92-94.